双抗巧克力琼脂培养基用于嗜血杆菌和奈瑟氏菌等苛养菌的培养，需要加入脱纤维羊血和万古霉素，多粘菌素B进行制备。
1.按照产品标签说明，称取8.8 g双抗巧克力琼脂干粉。
2.倒入盛有200 mL纯化水的搪瓷缸中，然后用玻璃棒不停搅拌，直到干粉完全溶解。
3.之后将搪瓷缸放置于电磁炉上，一边加热，一边搅拌，当液面完全沸腾后，立即将搪瓷缸从电磁炉上拿开，为第一次煮沸，当液面回落后立即放回电磁炉加热，重复加热煮沸，共煮沸2-3次，之后倒入三角瓶中，包好。
4.放置于高压灭菌锅中，121℃灭菌15分钟。
5.灭菌结束后，取出培养基，待培养基冷至50℃左右时，用移液枪吸取14 mL无菌脱纤维羊血（添加量为7%），缓慢加入三角瓶中，不断摇晃使其与培养基充分混匀；将三角瓶放置于80℃水浴中加热10 min左右，不停摇动，直至培养基颜色变成棕色（巧克力色）。
6.待培养基冷至45℃-50℃时，用移液枪吸取一支双抗巧克力琼脂添加剂（含万古霉素0.66 mg，多粘菌素B 0.84 mg），缓慢加入三角瓶中，并不断摇晃使其与培养基充分混匀，倾入无菌平皿，备用。
7.配制好的双抗巧克力平板应为巧克力色固体，表面平整。
检验原理
双抗巧克力琼脂培养基用于嗜血杆菌和奈瑟氏菌等苛养菌的培养，各种消化物和酵母浸出粉提供碳氮源、维生素和生长因子；淀粉能促进奈瑟氏菌的生长；氯化钠维持均衡的渗透压；多粘菌素、万古霉素抑制了革兰氏阳性菌的生长，更有利于嗜血杆菌和奈瑟氏菌的生长；琼脂是培养基的凝固剂；脱纤维羊血提供氯化血红素和辅酶I，血液中还含有V、X因子，这两种因子是位于红细胞中的，一般细菌不能利用，轻微的加热（一般为75℃~85℃左右）使红细胞破坏释放出V、X因子。
注意事项
1.无菌脱纤维羊血必须提前从冰箱中取出，待其恢复至室温后使用。
2.加入羊血和抗生素时需注意不断摇晃三角瓶，使其与培养基充分混匀。
3.80℃水浴中加热后可以不加双抗巧克力琼脂添加剂（含万古霉素0.66 mg，多粘菌素B 0.84 mg），直接倒平板，即为巧克力琼脂平板，也可用于培养苛养菌。
