标准依据：《GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测》

1 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。

1.1 恒温培养箱:37℃士1℃。

1.2 冰箱:2℃～5℃。

1.3 恒温水浴箱:80℃±1℃.

1.4 天平:感量为0.1g。

1.5 均质器及无菌均质袋,均质杯。

1.6 振荡器。

1.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

1.8 无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。

1.9 无菌培养皿:直径90mm。

1.10 显微镜:10倍一100倍。

1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2 培养基和试剂

2.1 营养琼脂培养基。

2.2 营养肉汤培养基。

2.3 无菌生理盐水。

2.4 革兰氏染色液。

2.5 细菌生化鉴定试剂盒。

3 检验程序

地衣芽孢杆菌的检验程序见下图。

4 操作步骤

4.1 样品制备

4.1.1 固体和半固体样品

称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打lmin～2min制成1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中,8000r/min～10000r/min均质lmin～2min制成1:10的样品匀液。

4.1.2 液体样品

应先将其充分摇匀后,以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇﹐制成1:10的样品匀液。

4.2 样品稀释

4.2.1 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取l:10样品匀液lmL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成l:100的样品匀液。

4.2.2 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次lml灭菌吸管或吸头。

4.3 培养

根据对待检样品菌含量的估计,选择2个～3个连续的适宜稀释度﹐每个稀释度水浴80℃±l℃维持10min,吸取菌液0.2 mL接种于营养琼脂平板内,使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面,涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后,将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48h±2h。

4.4 菌落计数

4.4.1 选取特征菌落数在20CFU～200CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于20CFU的平板记录具体菌落数,大于200CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

4.4.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。

4.4.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。

4.5 鉴定

4.5.1 菌落挑选和纯培养

挑选平板上5个白色不透明、湿润、边缘光滑的菌落分别转入营养肉汤培养基37℃±1℃厌氧培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。

4.5.2 形态学鉴定

革兰氏染色,镜检。地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌,呈杆状,长度1.5u.m～3.5um,单个、成对或短链状排列,有芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大。

4.5.3 生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴别特征参见表B.4。

5 结果计算

5.1每个平板中地衣芽孢杆菌的数量

每个平板中地衣芽孢杆菌菌落数的计算见式(1):

  a=b/A×C                 ...............（1）

  式中

  a-每块平板上的地衣芽孢杆菌菌落数;

  b-挑取后经证实为地衣芽孢杆菌的菌落数;

  A-挑取平板上用于验证的菌落数;

  C-平板上的所有特征菌落数。

5.2 菌落总数的计算方法

5.2.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板中地衣芽孢杆菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫升)中菌落总数结果。

5.2.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(2)计算:

  N=∑C/（n1+0.1n2）×d         ...............（2）

  式中:

  N-样品中菌落数;

  ∑C-平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;

  n₁-第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;

  n₂-第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;

  d-稀释因子(第一稀释度)。

6 报告

6.1 结果判定

若样品菌落符合地衣芽孢杆菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为地衣芽孢杆菌。

6.2 结果报告

6.2.1 定性报告

在25g(mL)样品中检出或未检出地衣芽孢杆菌。

6.2.2 定量报告

菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时,对第3位数字进行修约后，取前2位数字,后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示,采用两位有效数字。

  本文节选自《GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测》。

附：

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GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测标准用到的培养基 点击下载

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