标准依据：《GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测》
1 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。
1.1 恒温厌氧培养箱:37℃士1℃。
1.2 冰箱:2℃～5℃。
1.3 天平:感量为0.1g。
1.4 均质器及无菌均质袋,均质杯。
1.5 振荡器。
1.6 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
1.7 无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。
1.8 无菌培养皿:直径90mm。
1.9 显微镜:10倍一100倍。
1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2 培养基和试剂
2.1 MRS琼脂培养基。
2.2 MRS肉汤培养基。
2.3 无菌生理盐水。
2.4 革兰氏染色液。
2.5 细菌生化鉴定试剂盒。
3 检验程序
嗜酸乳杆菌的检验程序见下图。
4 操作步骤
4.1 样品制备
4.1.1 固体和半固体样品
称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打lmin～2min制成1：10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中,8000r/min～10000r/min均质lmin～2min制成1：10的样品匀液。
4.1.2 液体样品
应先将其充分摇匀后,以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇﹐制成1∶10的样品匀液。
4.2 样品稀释
4.2.1 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液lmL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1：100的样品匀液。
4.2.2 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
4.3 培养
根据对待检样品菌含量的估计,选择2个～3个连续的适宜稀释度﹐每个稀释度吸取样品匀液0.1ml接种于MRS琼脂平板内,使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面,涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后,将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48±2h。
4.4 菌落计数
4.4.1 选取特征菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
4.4.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
4.4.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
4.5 鉴定
4.5.1 菌落挑选和纯培养
挑选平板上5个凸起,表面粗糙,边缘卷曲的菌落分别转入MRS肉汤培养基37℃±1℃厌氧培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。
4.5.2 形态学鉴定
革兰氏染色,镜检。嗜酸乳杆茵为革兰氏阳性杆菌,呈杆状,两端圆,长度0.9u.m～6.0um,单个、成对或成链状,无鞭毛,无芽孢。
4.5.3 生化鉴定
使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见表B.2。乳杆菌属常见菌种主要鉴别特征参见表C.1。
5 结果计算
5.1 每个平板中嗜酸乳杆菌的数量
每个平板中嗜酸乳杆菌菌落数的计算见式(1):
a=b/A×C ...............（1）
式中：
a-每块平板上的嗜酸乳杆菌菌落数；
b-挑取后经证实为嗜酸乳杆菌的菌落数；
A-挑取平板上用于验证的菌落数；
C-平板上的所有特征菌落数。
5.2 菌落总数的计算方法
5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板中嗜酸乳杆菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫升)中菌落总数结果。
5.2.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(2)计算:
N=∑C/（n1+0.1n2）×d ...............（2）
式中:
N-样品中菌落数；
∑C-平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；
n1-第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；
n2-第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；
d-稀释因子(第一稀释度)。
6 报告
6.1 结果判定
若样品菌落符合嗜酸乳杆菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为嗜酸乳杆菌。
6.2 结果报告
6.2.1 定性报告
在25g(mL)样品中检出或未检出嗜酸乳杆菌。
6.2.2 定量报告
菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时,对第3位数字进行修约后，取前2位数字,后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示,采用两位有效数字。
本文节选自《GB/T 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测》。
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