食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验(GB 4789—2012)

前言
本标准代替 GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》。
本标准与 GB/T 4789.13—2003 相比，主要变化如下：
——修改了标准的中文名称；
——修改了样品制备过程；
——修改了培养基与试剂；
——修改了操作步骤；
——修改了菌数计算部分；
——增加了附录 A。

食品安全国家标准
食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验
1 范围
本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。
本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a）恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；
b）冰箱：2 ℃～5℃；
c）恒温水浴箱：50℃±1 ℃，46℃±0.5℃；
d）天平：感量 0.1 g；
e）均质器；
f）显微镜：10×～100×；
g）无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；
h）无菌试管：18mm×180mm；
i）无菌培养皿：直径 90 mm；
j）pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；
k）厌氧培养装置。
3?培养基和试剂
3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录 A 中 A.1。
3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录 A 中 A.2。
3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录 A 中 A.3。
3.4乳糖-明胶培养基：见附录 A 中 A.4。
3.5含铁牛乳培养基：见附录 A 中 A.5。
3.60.1%蛋白胨水：见附录 A 中 A.6。
3.7革兰氏染色液：见附录 A 中 A.7。
3.8硝酸盐还原试剂：见附录 A 中 A.8。
3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中 A.9。
4 检验程序
产气荚膜梭菌检验程序见图 1。

5?操作步骤
5.1?样品制备
5.1.1?样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在 2 ℃～5 ℃保存；如 8 h 内不能进行检验，应以 无菌操作称取 25 g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60 ℃ 低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
5.1.2?以无菌操作称取 25 g（mL）样品放入含有 225 mL 0.1%蛋白胨水（如为 5.1.1 中冷冻保存样品， 室温解冻后，加入 200 mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质 1 min～2 min；或 置于盛有 225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8 000 r/min～10 000 r/min 均质 1min～2 min，作为 1:10 稀释 液。
5.1.3?以上述 1:10 稀释液按 1 mL 加 0.1%蛋白胨水 9 mL 制备 10-2～10-6的系列稀释液。

5.2培养

5.2.1吸取各稀释液 1 mL 加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至 50℃的 TSC 琼脂（可放置于 50℃±1℃恒温水浴箱中保温）15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。 5.2.2上述琼脂平板凝固后,再加 10mL 冷却至 50℃的TSC琼脂（可放置于 50℃±1 ℃恒温水浴箱 中保温）均匀覆盖平板表层。
5.2.3待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内,36℃1℃培养20 h～24 h
5.2.4典型的产气荚膜梭菌在 TSC 琼脂平板上为黑色菌落。
5.3确证试验
5.3.1从单个平板上任选 5 个（小于 5 个全选）黑色菌落，分别接种到 FTG 培养基，36℃±1℃培养
18 h～24h。
5.3.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有 时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种 TSC 琼脂平板进行分纯，36 ℃1℃厌氧培养 20 h～24 h， 挑取单个典型黑色菌落接种到 FTG 培养基，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，用于后续的确证试验。
5.3.3取生长旺盛的 FTG 培养液 1 mL 接种于含铁牛乳培养基，在 46 ℃±0.5 ℃水浴中培养 2 h 后，每 小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上 升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发 酵”现象，但培养基不变黑。
5.3.4用接种环（针）取 FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于 36 ℃±1 ℃培养 24 h。在透 射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌 株只沿穿刺线生长。然后滴加 0.5 mL 试剂甲和 0.2 mL 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min 内出现红 色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置 10 min，出现红色者， 表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
5.3.5用接种环（针）取 FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于 36 ℃±1 ℃培养 24 h，观察结果。 如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于 5 ℃左右放置 1 h，检查明胶液化情况。 如果培养基是固态，于 36 ℃±1 ℃再培养 24 h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使 明胶液化。

式中：
T——样品中产气荚膜梭菌的菌落数；
A——单个平板上典型菌落数；
B——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；
C——单个平板上用于确证试验的菌落数；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；
0.1——稀释系数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
6.3报告
根据 TSC 琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照 6.2 中公式计算，报告每 g（mL）样品中产 气荚膜梭菌数，报告单位以 CFU/ g（mL）表示；如 T 值为 0，则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告。