高分辨熔解曲线(high resolution melt，HRM)分析是2003年美国Utah大学Wittwer实验室提出的一项检测基因突变的新技术[1]。该技术利用DNA链中的任何突变、SNP、GC含量的改变及长度的变化等都会影响熔解曲线的Tm值及峰形的原理，在含有饱和荧光染料的体系中进行常规PCR反应，随后在real-time PCR仪中，对产物进行升温变性、采集荧光数据，根据熔解曲线的峰形及Tm值检测特定的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)，同时也可以发现新的SNP。目前HRM分析已广泛应用于细菌的鉴定、基因分型、重复序列分析、突变扫描及甲基化检测等多个领域。随着分子生物学技术的发展，大量高通量测序工作的完成，为HRM突变位点的检测提供了新的靶点，并促进了该技术的进一步发展。
一、高分辨熔解曲线分析概述
双链DNA随着温度升高变性形成单链DNA，其中50% DNA分子发生变性的温度称为熔解温度(melting temperature，Tm值)。荧光染料与双链DNA结合时才能够发出荧光，当DNA变性形成单链时，荧光染料自DNA链上脱落下来，荧光信号便急剧减弱。以温度为横坐标对荧光信号作图，即可得到熔解曲线。DNA链中的任何突变及GC含量的改变都会影响熔解曲线的Tm值及峰形。
目前HRM分析所用的荧光染料主要是饱和荧光染料，如LC GreenPlus(idaho)等。饱和荧光染料不仅与DNA有更强的结合能力并且对PCR反应无抑制作用。饱和荧光染料在饱和浓度条件下对DNA双链进行标记，在升温解链的过程中不会发生染料分子之间的重排，细微的序列差异即可通过荧光信号的变化体现出来。HRM的目的是能够对单个碱基差异进行区分，因此除了对荧光染料有特殊要求外，其对real-time PCR仪要求也较高。需要PCR仪孔间温度差异小于0.2 ℃，每步升温0.02～0.1 ℃，而且每升高1 ℃荧光采集次数大于10次。此外，为了提高HRM检测的灵敏度和分辨率，相关仪器还需要高能量的激发光源以检测熔解曲线的微小变化。
HRM技术自2003年被首次提出后，一直向着高灵敏(单分子)、高通量和高效率的方向发展，目前该技术已经被广泛应用到生物研究的各个领域中，其中在细菌感染性疾病临床诊断中的应用主要包括细菌病原体的鉴定及耐药性的检测等方面。
二、高分辨熔解曲线分析在临床细菌快速鉴定中的应用
目前细菌感染性疾病病原学诊断的金标准仍然为培养的方法。然而传统的培养方法耗时较长，通常不能满足临床诊治的需求。16S rRNA基因由于其在细菌进化中的保守性，常常作为病原菌鉴定的标准标识序列。以16S rRNA基因作为靶基因进行的HMR分析技术，操作便捷、灵敏度高，且PCR反应后即可得到结果，是分子生物学技术应用于临床菌株诊断的重要进展。近两年来有多项研究利用PCR-HRM技术对细菌感染性疾病的病原菌进行了快速鉴定。例如，非发酵革兰阴性杆菌是囊性纤维化或慢阻肺患者疾病发生发展的主要病原，而传统的细菌培养鉴定方法耗时较长，为了临床早期治疗方案的合理选择，Navratilova等[2]设计了针对16S rRNA基因4个区域的引物，建立了PCR-HRMA方法，并用该方法对来自65例患者临床样本纯培养的275株菌进行了鉴定，结果发现PCR-HRMA的鉴别能力远高于传统的表型的鉴定方法。此外，对于慢生长细菌如分枝杆菌，不同种的分枝杆菌所引起的临床症状往往相似但其治疗方案相去甚远，因此分枝杆菌菌种的鉴定对临床治疗至关重要，而传统的培养为基础的鉴定方法难以满足临床需求。Issa等[3]用qPCR-HRM分析16S rRNA基因实现了对8种共18株分枝杆菌的快速鉴定，并为临床合理用药提供了可靠的依据。小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌感染不仅可以引起急性消化系统炎症，还可以导致全身系统性感染。这两种耶尔森菌入血引发的全身感染，需要选用不同的抗生素进行治疗。Souza等[4]根据小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌16S rRNA基因V3区140 bp片段序列的差异设计引物，利用PCR-HRM方法能够对这两种耶尔森菌进行鉴定，为临床抗生素的选择提供指导。
在感染性疾病致病机制上，同一种病原菌由于其血清型及毒力基因的不同，其致病性及治疗方案也可能完全不同。针对菌株特异性序列设计引物，PCR-HRM分析对同一病原菌中不同血清型及毒力的菌株也可以进行很好的鉴别。肠道感染致病菌如沙门菌属、志贺菌和致病性大肠埃希菌的血清学分型是临床诊断和疾病传播控制的必要技术，但医院临床实验室受诊断血清购买渠道和分型类别所限，难以满足需求。PCR-HRM技术在这一领域得到广泛应用。如结合SYBR ® Green Real-time PCR和HRM方法对5种主要的肠道致病性大肠埃希菌血清型(O26, O103, O111, O145和O157)进行鉴别诊断[5]。Banowary等[6]针对空肠弯曲菌hipO基因和大肠弯曲菌asp基因片段的差异，利用PCR-HRM分析技术实现了这两种弯曲菌的检测与鉴定，该技术对临床样本鉴定的敏感度和特异度分别是100%和92%。Ohshima等[7]将rarA和ldh基因作为HRM分析的靶基因对9种李斯特菌进行鉴定，并与16S rRNA基因测序结果进行比较，其一致率为92.6%。而以nuc和Sa442基因为靶点的HRM能够实现对金黄色葡萄球菌的分型鉴定[8]。以16S-23S rRNA内部间隔序列为靶标的HRM分析能够一次反映鉴别12种非结核分枝杆菌[9]。PCR-HRM分析对临床病原菌快速、准确的鉴定，为感染性疾病的及时治疗提供了极大的帮助。同时，HRM分析在疫苗研发方面也显示出应用前景。如肠道沙门菌肠炎血清型是人类腹泻的主要病原菌，其主要来源为污染的禽肉类及其制品。为了减少禽类的感染，全球多个国家使用了沙门菌疫苗菌株。为了区别疫苗菌株与野生毒株，Maurischat等利用非标记探针标记法(Unlabeled Probe High Resolution Melting, UP-HRM)针对肠炎沙门菌疫苗菌株和野生菌株nhaA和kdpA基因的序列差异设计引物，实现了两者间的鉴别[10]。
三、高分辨熔解曲线分析在抗感染药物敏感性检测中的应用
抗菌药物作用靶点基因突变是细菌产生耐药性的主要机制之一。因此，利用HRM方法检测与细菌耐药相关基因的位点突变，能够快速准确地判定病原体的耐药性。Dona等[11]针对淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)菌株基因组特点，使用9对引物对其进行HRM分析建立了一种基于SYBGreen的HRM方法，同时实现了NG菌株的鉴定及耐药检测。该方法通过对193株临床菌株的验证发现其灵敏性和特异性与培养的方法完全一致。结核病是重要的公共卫生问题，HRM技术在结核分枝杆菌耐药性检测中也有较好的应用价值。结核分枝杆菌的耐药主要与某些特定基因的突变相关。如rpoB基因突变与利福平耐药相关，gyrA基因突变与喹诺酮类耐药相关，katG基因与异烟肼耐药相关。因此利用HRM技术检测特定基因的SNP就可以快速鉴定出结核分枝杆菌的耐药性。目前已有多项研究使用HRM技术对临床常用抗结核药物(利福平、异烟肼、氧氟沙星、链霉素及吡嗪酰胺)进行耐药性检测[12,13,14,15,16]。其中Galarza等使用HRM的方法检测秘鲁167株结核分枝杆菌临床菌株中的多耐药结核分枝杆菌并与药敏试验结果相比较，发现该方法对利福平耐药的敏感性和特异性分别是98.7%和97.5%，对异烟肼耐药菌株检测的敏感度和特异度分别是98.7%和100%[17]。在沙门菌耐药性检测中，HRM通过检测沙门菌gyrase基因的喹诺酮类耐药决定区(quinolone-resistant determining region，QRDR)和拓扑异构酶Ⅳ基因的突变，能够快速鉴定出喹诺酮及氟喹诺酮耐药沙门菌[18]。此外，HRM技术也可直接检测临床样本中致病菌的耐药性，如使用HRM技术自无症状小学生鼻咽部检测红霉素耐药百日咳杆菌[19]。
细菌耐药的遗传基础除了染色体介导外，更多的是质粒介导的耐药。如质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶(pmAmpC)是一种新型C类β-内酰胺酶，根据与染色体C类酶氨基酸序列的同源性，可分为6类(blaMOX、blaFOX、blaCMY-2、blaDHA、blaACC和blaACT)。除了介导细菌对第一、二、三代头孢菌素、头霉素、氨曲南的耐药，pmAmpC甚至能够使外膜蛋白丢失的菌株出现对碳青霉烯类的耐药。Geyer等人分别针对6类pmAmpC基因设计引物，使用HRM技术对其进行检测，其灵敏性和特异性分别为96%和100%[20]。
HRM技术在院内感染的监测与鉴定中也有较好的应用。Wong等[21]针对院内感染常见的5种细菌(鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌以及MRSA)其种属特异性基因区域分别设计引物，在一个多重PCR反应后，分析其熔解曲线，根据5种细菌PCR产物熔解温度的不同，实现对菌株的鉴定。随后，研究者们用150株临床菌株对该HRM方法进行验证，其准确性达到100%。此外，HRM的方法还可以直接监测耐药菌株的传播。Woksepp等[22]将连接介导PCR(LM/PCR)与HRM联用，快速检测了由ESBL大肠埃希菌引起的院内感染暴发。HRM在院内感染菌株的快速鉴定及耐药菌株传播监测中的应用，能够有效地提高医院的医疗质量，减少患者不必要的痛苦和经济负担。
近年，随着交叉学科的发展，基于熔解曲线分析的微流控床旁一体化检测技术已逐步从研究走向临床。例如，可检测呼吸道感染、血流感染、中枢神经系统感染和胃肠道感染的多种病原体靶标以及抗生素耐药基因的FilmArray?系统。该技术利用巢式二步PCR结合熔解曲线分析，PCR产物熔解曲线提供了产物特异的"指纹图谱"，实现多重、高灵敏度和高特异性检测。该方法检测一个样本手工操作仅耗时2 min，运行时间仅为约1 h，并且在一个密闭系统中进行提取、扩增和检测，可最大限度减少污染。快速获得的检测结果所提供的必要信息有助于初级医护人员和急诊室医生更好地对患者进行分诊，并及时制定可靠的医疗决策。
四、展望
HRM自问世以来，在感染性疾病的临床诊断中得到了广泛的研究和评估。由于其操作简单、结果准确、耗时短及成本低等优点，在国外已经广泛应用于许多实验室自建项目的临床检测中，基于熔解曲线分析的多重病原菌及耐药分析一体化床旁检测商品化系统已经面世，为感染性疾病诊治带来创新性突破。在国内由于尚未开放临床实验室自建项目检测，而价格高昂的进口商品化系统难以普及大众，目前尚未应用于临床标本检测。但HRM技术在临床细菌鉴定及药敏检测中具有巨大的潜力，在不久的将来必定会在细菌感染性疾病的预防与治疗中发挥重要作用。
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