前言
本标准代替GB4789.15-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和群母计数》和SN/T 2552.3-2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法第3部份：酵母、霉菌菌落计数》。
本标准与GB 4789.15-2010相比.主要变化如下:
一修改了设各和材料;
一修改了培养基和试剂;
一修改了检验程序和操作步骤;
一修改了结果与报告;
一修改了附录A;
一附录B修改为第二法。
1 范围
本标准规定了食品中霉菌和酵母(moulds and yeasts)的计数方法。
本标准第一法适用于各类食品中霉菌和酵母的计数,第二法适用于番茄酱罐头、番茄汁申霉菌的计数。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1培养箱:28℃±1℃。
2.2 拍击式均质器及均质袋。
2.3 电子天平,感量0.1g。
2.4 无菌锥形瓶:容量500mL。
2.5 无茵吸管:1 mL(具0.01 mL刻度).10mL(具0.1 mL刻度)。
2.6 无菌试管: 18mm×180mm。
2.7 旋涡混合器。
2.8 无菌平皿:宜径90mm。
2.9 恒温水浴箱:46℃士1℃。
2.10 显微镜:10倍-100倍。
2.11微量移液器及枪头:1.OmL。
2.12 折光仪
2.13 郝氏计测玻片:具有标准计测室的特制玻片。
2.14 出盖玻片。
2.15 测微器:具标准刻度的玻片。
3 培养基和试剂
3.1 生理盐水:见A.1。
3.2 马铃薯葡萄糖琼脂：见A.2。
3.3 孟加拉红琼脂:见A.3。
3.4 磷酸盐缓冲液:见A.4。
第一法 霉菌和酵母平板计数法
4 检验程序
霉菌和酵母平板计数洼的检验程序见图1。
5 操作步骤
5.1样品的稀释
5.1.1 固体和半固体样品:称取25 g样品,加人225 mL无菌稀释液(蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液),充分振摇,或用拍击式均质器拍打1 min-2 m心制成1 : 10的样品匀液。
5.1.2 液体样晶:以无菌吸管吸取25 mL样晶至盛有225 mL无茵稀释液(蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液)的适宜容器内(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或无菌均质袋中,充分振摇或用拍击式均质器拍打1 min-2 min,制成1-10的样品匀液。
5.1.3 取1 mLl: 10样晶匀液注人含有9mL无菌稀释液的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,或在旋涡混合器上混匀,此液为1 : 100的样品匀液。
5.1.4接5.1.3操作,制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1支1 mL无菌吸管。
5.1.5 根据对样品污染状况的估计,选择2个一3个适宜稀释度的样晶匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1 mL样晶匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL无菌稀释液加人2个无菌平皿作空自对照。
5.1.6 及时将20 mL-25 mL冷却至46 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼脂(可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾汪平皿.并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待蜡养基完全凝固。
5.2 培养
琼脂凝固后,正置平板,置28 ℃±1 ℃培养箱中培养,观察并记录培养至第5 d的结果。
5.3 苗落计敬
用肉眼观察,必要时可用放大镜或低倍镜,记录稀释倍数和相应的霉菌和酵母菌落数。以菌落形成单位(coiony-formingunits,CFU)表示。
选取菌落数在10 CFU-150 CFU的平板,根据菌落形态分别计数霉茵和酵母。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。
6 结果与报告
6.1 结果
6.1.1 计算同一稀释度的两个平板茵落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数。
6.1.2 若有两个稀释度平板上菌落数均在10 CFU-150 CFU之间,则按照GB 4789.2的相应规定进行计算。
6.1.3 若所有平板上菌落数均大于150 CFU,则对稀释度最高的平板迸行计数,其他平板可记录为多不可计,结果接平均菌落数乘以最离稀释倍数计算。
6.1.4 若所有平板上菌落数均小于10 CFU,则应接稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6.1.5 若所有稀释度(包括液体样晶原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在10 CFU-150 CFU之间.其中一部分小于10 CFU或大于150 CFU时,则以最接近10 CFU或1ap CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6.2 报告
6.2.1菌落数接“四舍五入”原则修约。菌落数在10以内时,采用一位有效数字报告;菌落数在10-100之间时,采用两位有效数字报告。
6.2.2 菌落数大于或等于100时,前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数来表示结果;也可用10的指数形式来表示,此时也接“四舍五人”原则修约,采用两位有效数字。
6.2.3 若空自对照平板上有菌落出现,则此次检测结果无效
6.2.4 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告,报告或分别报告霉菌和/或酵母数。
第二法 霉菌直接镜检计数法
7 操作步骤
7.1 检样的制备:取适量检样.加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447-1.3460(即浓度为7.9%一8.8%),备用。
7.2 显微镜标准视野的校正:将显微镜按放大率90倍一125倍调节标准视野,使其宜径为1.382 mm。
7.3 涂片:洗净郝氏计测玻片.将制好的标准液.用玻璃棒均匀的摊布于计测室,加益玻片,以备观察。
7.4 观测:将制好之载玻片置于显微镜标准视野下进行观测。一般每一检样每人观察50个视野。同一检样应由两人进行观察。
7.5 结果与计算:在标准视野下,发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野(1.382 mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6(即测微器的一格)时即记录为阳性(+),否则记录为阴性(一)。
7.6 报告:报告每100个视野中全部阳性视野数为霉菌的视。百分数(视野%)。
附录A
培养基和试剂
A.1 生理盐水
A.1.1 成分
氯化钠 8.5g
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
氯化钠加入1000 mL蒸馏水中,搅拌至完全溶解,分装后,121 ℃灭菌15 mh,备用。
A.2 马铃薯葡萄搪琼脂
A.2.1成分
马铃薯(去皮切块) 300 g
葡萄糖 20.0 g
琼脂 20.0 g
氯霉素 0.1g
蒸馏水 1000 mL
A.2.2 制法
将马铃薯去皮切块,加1000mL蒸馏水,煮沸10 min-20 min。用纱布过滤.补加蒸馏水至1000 ml加入葡萄糖和琼脂，加热溶解，分装后,121 ℃灭菌15 min,备用。
A.3 孟加拉红琼脂
A.3.1成分
蛋白胨 5.0 g
葡萄糖 10.0 g
磷酸二氢钾 1.0 g
硫酸镁(无水) 0.5g
琼脂 20.0 g
孟加拉红 0.033 g
氯霉素 0.1 g
蒸馏水 1000 mL
A.3.2 制法
上述各成分加人蒸馏水申,加热溶解,补足燕馏水至1000 mL.分装后.121 ℃灭菌15 min避光保存备用。
A.4 磷酸盐缓冲液
A.4.1成分
磷酸二氢钾 34.0 g
蒸馏水 500 mL
A.4.2 制法
贮存液:称取34.O g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液凋节pH至7.2±0.1用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。
稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1000 mL,分装于适宜容器申,121 ℃高压灭菌15min。
