前 言
本标准代替GB/T4789.6—2003《食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》。
本标准与GB/T4789.6—2003相比,主要变化如下:
———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验”;
———增加了术语和定义、缩略语;
———增加了血清学试验中H 抗原鉴定;
———增加了PCR确认试验;
———增加了附录A;
———修改了设备和材料;
———修改了培养基和试剂;
———修改了检验程序;
———修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的O 抗原群;
———删除了肠毒素试验。
1 范围
本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenicEscherichiacoli)的检验方法。
本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验。
2 术语和定义、缩略语
2.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1.1 致泻大肠埃希氏菌 DiarrheagenicEscherichiacoli
一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌,可经过污染食物引起人类发病。常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌(包括肠道出血性大肠埃希氏菌)和肠道集聚性大肠埃希氏菌。
2.1.2 肠道致病性大肠埃希氏菌 EnteropathogenicEscherichiacoli
能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤,且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌。该菌是婴幼儿腹泻的主要病原菌,有高度传染性,严重者可致死。
2.1.3 肠道侵袭性大肠埃希氏菌 EnteroinvasiveEscherichiacoli
能够侵入肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌。该菌无动力、不发生赖氨酸脱羧反应、不发酵乳糖,生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌。侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的抗原编码基因及其调控基因,如ipaH 基因、ipaR 基因(又称为invE 基因)。
2.1.4 产肠毒素大肠埃希氏菌 EnterotoxigenicEscherichiacoli
能够分泌热稳定性肠毒素或/和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌。该菌可引起婴幼儿和旅游者腹泻,一般呈轻度水样腹泻,也可呈严重的霍乱样症状,低热或不发热。腹泻常为自限性,一般2d~3d即自愈。
2.1.5 产志贺毒素大肠埃希氏菌 Shigatoxin-producingEscherichiacoli(肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichiacoli)
能够分泌志贺毒素、引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌。有些产志贺毒素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎(HC)或血性腹泻,并可进一步发展为溶血性尿毒综合征(HUS),这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌。
2.1.6 肠道集聚性大肠埃希氏菌 EnteroaggregativeEscherichiacoli
肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵入肠道上皮细胞,但能引起肠道液体蓄积。不产生热稳定性肠毒素或热不稳定性肠毒素,也不产生志贺毒素。唯一特征是能对Hep-2细胞形成集聚性黏附,也称Hep-2细胞黏附性大肠埃希氏菌。
2.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
2.2.1 DEC:致泻大肠埃希氏菌 DiarrheagenicEscherichiacoli
2.2.2 EPEC:肠道致病性大肠埃希氏菌 EnteropathogenicEscherichiacoli
2.2.3 EIEC:肠道侵袭性大肠埃希氏菌 EnteroinvasiveEscherichiacoli
2.2.4 ETEC:产肠毒素大肠埃希氏菌 EnterotoxigenicEscherichiacoli
2.2.5 STEC:产志贺毒素大肠埃希氏菌 Shigatoxin-producingEscherichiacoli
2.2.6 EHEC:肠道出血性大肠埃希氏菌 EnterohemorrhagicEscherichiacoli
2.2.7 EAEC:肠道集聚性大肠埃希氏菌 EnteroaggregativeEscherichiacoli
2.2.8 escV:蛋白分泌物调节基因,geneencodingLEE-encodedtypeⅢsecretionsystemfactor
2.2.9 eae:紧密素基因,geneencodingintiminforEscherichiacoliattachingandeffacing
2.2.10 bfpB:束状菌毛B基因,bundle-formingpilusB;
2.2.11 stx1:志贺毒素Ⅰ基因,Shigatoxinone
2.2.12 stx2:志贺毒素Ⅱ基因,Shigatoxintwo
2.2.13 lt:热不稳定性肠毒素基因,heat-labileenterotoxin
2.2.14 st:热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxin
2.2.15 stp (stIa):猪源热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredintheisolatesfrompigs
2.2.16 sth (stIb):人源热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredintheisolatesfromhuman
2.2.17 invE:侵袭性质粒调节基因,invasiveplasmidregulator
2.2.18 ipaH :侵袭性质粒抗原H 基因,invasiveplasmidantigenH-gene
2.2.19 aggR:集聚黏附菌毛调节基因,aggregativeadhesivefimbriaeregulator
2.2.20 uidA :β-葡萄糖苷酶基因,β-glucuronidasegene
2.2.21 astA :集聚热稳定性毒素A 基因,enteroaggregativeheat-stableenterotoxinA
2.2.22 pic:肠定植因子基因,proteininvolvedinintestinalcolonization
2.2.23 LEE:肠细胞损伤基因座,Locusofenterocyteeffacement
2.2.24 EAF:EPEC黏附因子,EPECadhesivefactor
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1 恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。
3.2 冰箱:2℃~5℃。
3.3 恒温水浴箱:50℃±1℃,100℃或适配1.5mL或2.0mL金属浴(95℃~100℃)。
3.4 电子天平:感量为0.1g和0.01g。
3.5 显微镜:10×~100×。
3.6 均质器。
3.7 振荡器。
3.8 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
3.9 无菌均质杯或无菌均质袋:容量500mL。
3.10 无菌培养皿:直径90mm。
3.11 pH 计或精密pH 试纸。
3.12 微量离心管:1.5mL或2.0mL。
3.13 接种环:1μL。
3.14 低温高速离心机:转速≥13000r/min,控温4℃~8℃。
3.15 微生物鉴定系统。
3.16 PCR仪。
3.17 微量移液器及吸头:0.5μL~2μL,2μL~20μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。
3.18 水平电泳仪:包括电源、电泳槽、制胶槽(长度>10cm)和梳子。
3.19 8联排管和8联排盖(平盖/凸盖)。
3.20 凝胶成像仪。
4 培养基和试剂
4.1 营养肉汤:见A.1。
4.2 肠道菌增菌肉汤:见A.2。
4.3 麦康凯琼脂(MAC):见A.3。
4.4 伊红美蓝琼脂(EMB):见A.4。
4.5 三糖铁(TSI)琼脂:见A.5。
4.6 蛋白胨水、靛基质试剂:见A.6。
4.7 半固体琼脂:见A.7。
4.8 尿素琼脂(pH7.2):见A.8。
4.9 氰化钾(KCN)培养基:见A.9。
4.10 氧化酶试剂:见A.10。
4.11 革兰氏染色液:见A.11。
4.12 BHI肉汤:见A.12。
4.13 福尔马林(含38%~40%甲醛)。
4.14 鉴定试剂盒。
4.15 大肠埃希氏菌诊断血清。
4.16 灭菌去离子水。
4.17 0.85%灭菌生理盐水。
4.18 TE(pH8.0):见A.13。
4.19 10×PCR反应缓冲液:见A.14。
4.20 25mmol/L MgCl2。
4.21 dNTPs:dATP、dTTP、dGTP、dCTP每种浓度为2.5mmol/L。
4.22 5U/LTaq酶。
4.23 引物。
4.24 50×TAE电泳缓冲液:见A.15。
4.25 琼脂糖。
4.26 溴化乙锭(EB)或其他核酸染料。
4.27 6×上样缓冲液:见A.16。
4.28 Marker:分子量包含100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp条带。
4.29 致泻大肠埃希氏菌PCR试剂盒。
5 检验程序
致泻大肠埃希氏菌检验程序见图1。
6 操作步骤
6.1 样品制备
6.1.1 固态或半固态样品
固体或半固态样品,以无菌操作称取检样25g,加入装有225mL营养肉汤的均质杯中,用旋转刀片式均质器8000r/min~10000r/min均质1min~2min;或加入装有225mL营养肉汤的均质袋中,用拍击式均质器均质1min~2min。
6.1.2 液态样品
以无菌操作量取检样25mL,加入装有225mL营养肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠),振荡混匀。
6.2 增菌
将6.1制备的样品匀液于36℃±1℃培养6h。取10μL,接种于30mL肠道菌增菌肉汤管内,于42℃±1℃培养18h。
6.3 分离
将增菌液划线接种MAC和EMB琼脂平板,于36 ℃±1 ℃培养18h~24h,观察菌落特征。在MAC琼脂平板上,分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色,不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色;在EMB琼脂平板上,分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽,不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色。
6.4 生化试验
6.4.1 选取平板上可疑菌落10个~20个(10个以下全选),应挑取乳糖发酵,以及乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落,分别接种TSI斜面。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、尿素琼脂(pH7.2)和KCN 肉汤。于36℃±1℃培养18h~24h。
6.4.2 TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸,靛基质阳性,H2S阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI斜面底层不产酸,或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物,均非大肠埃希氏菌。必要时做革兰氏染色和氧化酶试验。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌,氧化酶阴性。
6.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
6.5 PCR 确认试验
6.5.1 取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行PCR确认试验。
注:PCR实验室区域设计、工作基本原则及注意事项应参照《疾病预防控制中心建设标准》(建标127—2009)和国家卫生和计划生育委员会(原卫生部)(2010)《医疗机构临床基因扩增管理办法》附录(医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则)。
6.5.2 使用1μL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h~24h的菌落,悬浮在200μL0.85%灭菌生理盐水中,充分打散制成菌悬液,于13000r/min离心3min,弃掉上清液。加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体,于100℃水浴或者金属浴维持10min;冰浴冷却后,13000r/min离心3min,收集上清液;按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液,取2μL作为PCR检测的模板;所有处理后的DNA
模板直接用于PCR 反应或暂存于4 ℃并当天进行PCR 反应;否则,应在-20 ℃以下保存备用(1周内)。也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA,操作方法按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。
6.5.3 每次PCR反应使用EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC标准菌株作为阳性对照。同时,使用大肠埃希氏菌ATCC25922或等效标准菌株作为阴性对照,以灭菌去离子水作为空白对照,控制PCR体系污染。致泻大肠埃希氏菌特征性基因见表1。
表1 五种致泻大肠埃希氏菌特征基因
6.5.4 PCR反应体系配制。每个样品初筛需配置12个PCR扩增反应体系,对应检测12个目标基因,具体操作如下:使用TE溶液(pH8.0)将合成的引物干粉稀释成100μmol/L储存液。根据表2中每种目标基因对应PCR体系内引物的终浓度,使用灭菌去离子水配制12种目标基因扩增所需的10×引物工作液(以uidA 基因为例,如表3)。将10×引物工作液、10×PCR 反应缓冲液25mmol/L MgCl2、2.5mmol/LdNTPs、灭菌去离子水从-20 ℃冰箱中取出,融化并平衡至室温,使用前混匀;5U/μLTaq 酶在加样前从-20℃冰箱中取出。每个样品按照表4的加液量配制12个25μL反应体系,分别使用12种目标基因对应的10×引物工作液。
6.5.5 PCR循环条件。预变性94℃5min;变性94℃30s,复性63℃30s,延伸72℃1.5min,30个循环;72℃延伸5min。将配制完成的PCR反应管放入PCR仪中,核查PCR反应条件正确后,启动反应程序。
6.5.6 称量4.0g琼脂糖粉,加入至200mL的1×TAE电泳缓冲液中,充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾,直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至60℃左右时,加入溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5μg/mL,充分混匀后,轻轻倒入已放置好梳子的模具中,凝胶长度要大于10cm,厚度宜为3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡,用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子,小心将胶块和胶床放入电泳槽中,样品孔放置在阴极端。向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液,液面高于胶面1mm~2mm 。将5μLPCR产物与1μL6×上样缓冲液混匀后,用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔,小心上样于孔中;阳性对照的PCR反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入2μL分子量Marker。接通电泳仪电源,根据公式:电压=电泳槽正负极间的距离(cm)×5V/cm 计算并设定电泳仪电压数值;启动电压开关,电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳30min~45min后,切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果,拍照并记录数据。
6.5.7 结果判定。电泳结果中空白对照应无条带出现,阴性对照仅有uidA 条带扩增,阳性对照中出现所有目标条带,PCR试验结果成立。根据电泳图中目标条带大小,判断目标条带的种类,记录每个泳道中目标条带的种类,在表5中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。
6.5.8 如用商品化PCR试剂盒或多重聚合酶链反应(MPCR)试剂盒,应按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。
6.6 血清学试验(选做项目)
6.6.1 取PCR试验确认为致泻大肠埃希氏菌的菌株进行血清学试验。
注:应按照生产商提供的使用说明进行O 抗原和H 抗原的鉴定。当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时,按生产商提供的使用说明进行。
6.6.2 O 抗原鉴定
6.6.2.1 假定试验:挑取经生化试验和PCR试验证实为致泻大肠埃希氏菌的营养琼脂平板上的菌落,根据致泻大肠埃希氏菌的类别,选用大肠埃希氏菌单价或多价OK 血清做玻片凝集试验。当与某一种多价OK血清凝集时,再与该多价血清所包含的单价OK 血清做凝集试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O 抗原群见表6。如与某一单价OK血清呈现凝集反应,即为假定试验阳性。
6.6.2.2 证实试验:用0.85%灭菌生理盐水制备O 抗原悬液,稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度。原效价为1∶160~1∶320的O 血清,用0.5%盐水稀释至1∶40。将稀释血清与抗原悬液于10mm×75mm 试管内等量混合,做单管凝集试验。混匀后放于50℃±1℃水浴箱内,经16h后观察结果。如出现凝集,可证实为该O 抗原。
6.6.3 H 抗原鉴定
6.6.3.1 取菌株穿刺接种半固体琼脂管,36℃±1 ℃培养18h~24h,取顶部培养物1环接种至BHI液体培养基中,于36℃±1℃培养18h~24h。加入福尔马林至终浓度为0.5%,做玻片凝集或试管凝集试验。
6.6.3.2 若待测抗原与血清均无明显凝集,应从首次穿刺培养管中挑取培养物,再进行2次~3次半固体管穿刺培养,按照6.6.3.1进行试验。
7 结果报告
7.1 根据生化试验、PCR确认试验的结果,报告25g(或25mL)样品中检出或未检出某类致泻大肠埃希氏菌。
7.2 如果进行血清学试验,根据血清学试验的结果,报告25g(或25mL)样品中检出的某类致泻大肠埃希氏菌血清型别。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 营养肉汤
A.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏3.0g
氯化钠5.0g
蒸馏水1000mL
A.1.2 制法
将以上成分混合加热溶解,冷却至25 ℃左右校正pH 至7.4±0.2,分装适当的容器。121 ℃灭菌15min。
A.2 肠道菌增菌肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨10.0g
葡萄糖5.0g
牛胆盐20.0g
磷酸氢二钠8.0g
磷酸二氢钾2.0g
煌绿0.015g
蒸馏水1000mL
A.2.2 制法
将以上成分混合加热溶解,冷却至25 ℃左右校正pH 至7.2±0.2,分装每瓶30mL。115 ℃灭菌20min。
A.3 麦康凯琼脂(MAC)
A.3.1 成分
蛋白胨20.0g
乳糖10.0g
3号胆盐1.5g
氯化钠5.0g
中性红0.03g
结晶紫0.001g
琼脂15.0g
蒸馏水1000mL
A.3.2 制法
将以上成分混合加热溶解,校正pH 至7.2±0.2。121℃高压灭菌15min。冷却至45℃~50℃,倾注平板。
注:如不立即使用,在2℃~8℃条件下可储存两周。
A.4 伊红美蓝(EMB)琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨10.0g
乳糖10.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0g
琼脂15.0g
2%伊红Y水溶液20.0mL
0.5%美蓝水溶液13.0mL
蒸馏水1000mL
A.4.2 制法
在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和乳糖,加水补足,冷却至25 ℃左右校正pH 至7.1±0.2。再加入琼脂,121℃高压灭菌15min。冷至45℃~50℃,加入2%伊红Y水溶液和0.5%美蓝水溶液,摇匀,倾注平皿。
A.5 三糖铁琼脂(TSI)
A.5.1 成分
蛋白胨20.0g
牛肉浸膏5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖1.0g
硫酸亚铁铵[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O] 0.2g
氯化钠5.0g
硫代硫酸钠0.2g
酚红0.025g
琼脂12.0g
蒸馏水1000mL
A.5.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加于400mL水中,搅拌均匀,静置约10min,加热使完全溶化,冷却至25℃左右校正pH 至7.4±0.2。另将琼脂加于600mL水中,静置约10min,加热使完全溶化。将两溶液混合均匀,加入5%酚红水溶液5 mL,混匀,分装小号试管,每管约3 mL。于121 ℃ 灭菌15min,制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用,在2℃~8℃条件下可储存一个月。
A.6 蛋白胨水、靛基质试剂
A.6.1 成分
胰蛋白胨20.0g
氯化钠5.0g
蒸馏水1000mL
A.6.2 制法
将以上成分混合加热溶解,冷却至25 ℃左右校正pH 至7.4±0.2,分装小试管,121 ℃高压灭菌15min。
注:此试剂在2℃~8℃条件下可储存一个月。
A.6.3 靛基质试剂
A.6.3.1 柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。
A.6.3.2 欧-波试剂:将1g 对二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。
A.6.4 试验方法
挑取少量培养物接种,在36℃±1℃培养1d~2d,必要时可培养4d~5d。加入柯凡克试剂约0.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5mL,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
A.7 半固体琼脂
A.7.1 成分
蛋白胨1.0g
牛肉膏0.3g
氯化钠0.5g
琼脂0.3g~0.5g
蒸馏水100.0mL
A.7.2 制法
按以上成分配好,加热溶解,冷却至25 ℃左右校正pH 至7.4±0.2,分装小试管。121 ℃灭菌15min,直立凝固备用。
A.8 尿素琼脂(pH7.2)
A.8.1 成分
蛋白胨1.0g
氯化钠5.0g
葡萄糖1.0g
磷酸二氢钾2.0g
0.4%酚红3.0mL
琼脂20.0g
20%尿素溶液100.0mL
蒸馏水1000mL
A.8.2 制法
除酚红、尿素和琼脂外的其他成分加热溶解,冷却至25℃左右校正pH 至7.2±0.2,加入酚红指示剂,混匀,于121℃灭菌15min。冷至约55℃,加入用0.22μm 过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100mL,混匀,以无菌操作分装灭菌试管,每管约3mL~4mL,制成斜面后放冰箱备用。
A.8.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
A.9 氰化钾(KCN)培养基
A.9.1 成分
蛋白胨10.0g
氯化钠5.0g
磷酸二氢钾0.225g
磷酸氢二钠5.64g
0.5%氰化钾20.0mL
蒸馏水1000mL
A.9.2 制法
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后121 ℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为1∶10000),分装于无菌试管内,每管约4mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
A.9.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36℃±1℃培养1d~2d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)。
注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。
A.10 氧化酶试剂
A.10.1 成分
N ,N ’-二甲基对苯二胺盐酸盐或
N ,N ,N ’,N ’-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g
蒸馏水100mL
A.10.2 制法
少量新鲜配制,于2℃~8℃冰箱内避光保存,在7d内使用。
A.10.3 试验方法
用无菌棉拭子取单个菌落,滴加氧化酶试剂,10s内呈现粉红或紫红色即为氧化酶试验阳性,不变色者为氧化酶试验阴性。
A.11 革兰氏染色液
A.11.1 结晶紫染色液
A.11.1.1 成分
结晶紫1.0g
95%乙醇20.0mL
1%草酸铵水溶液80.0mL
A.11.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A.11.2 革兰氏碘液
A.11.2.1 成分
碘1.0g
碘化钾2.0g
蒸馏水300mL
A.11.2.2 制法
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
A.11.3 沙黄复染液
A.11.3.1 成分
沙黄0.25g
95%乙醇10.0mL
蒸馏水90.0mL
A.11.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A.11.4 染色法
A.11.4.1 涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。
A.11.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
A.11.4.3 滴加95%乙醇脱色约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。
A.11.4.4 滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。
A.12 BHI肉汤
A.12.1 成分
小牛脑浸液200g
牛心浸液250g
蛋白胨10.0g
NaCl 5.0g
葡萄糖2.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4) 2.5g
蒸馏水1000mL
A.12.2 制法
按以上成分配好,加热溶解,冷却至25 ℃左右校正pH 至7.4±0.2,分装小试管。121 ℃灭菌15min。
A.13 TE(pH8.0)
A.13.1 成分
1mol/LTris-HCl(pH8.0) 10.0mL
0.5mol/LEDTA(pH8.0) 2.0mL
灭菌去离子水988mL
A.13.2 制法
将1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.5mol/LEDTA 溶液(pH8.0)加入约800mL灭菌去离子水均匀,再定容至1000mL,121℃高压灭菌15min,4℃保存。
A.14 10×PCR 反应缓冲液
A.14.1 成分
1mol/LTris-HCl(pH8.5) 840mL
氯化钾(KCl) 37.25g
灭菌去离子水160mL
A.14.2 制法
将氯化钾溶于1mol/LTris-HCl(pH8.5),定容至1000mL,121℃高压灭菌15min,分装后-20℃保存。
A.15 50×TAE电泳缓冲液
A.15.1 成分
Tris 242.0g
EDTA-2Na(Na2EDTA·2H2O) 37.2g
冰乙酸(CH3COOH) 57.1mL
灭菌去离子水942.9mL
A.15.2 制法
Tris和EDTA-2Na溶于800mL灭菌去离子水,充分搅拌均匀;加入冰乙酸,充分溶解;用1mol/lNaOH 调pH 至8.3,定容至1L后,室温保存。使用时稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液。
A.16 6×上样缓冲液
A.16.1 成分
溴酚蓝0.5g
二甲苯氰FF 0.5g
0.5mol/LEDTA(pH8.0) 0.06mL
甘油360mL
灭菌去离子水640mL
A.16.2 制法
0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶于500mL灭菌去离子水中,加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解,与甘油混合,定容至1000mL,分装后4℃保存。
