前 言
本标准代替GB4789.4—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、SN0170—1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第5部分:沙门氏菌检验》。
整合后的标准与GB4789.4—2010相比,主要变化如下:
———修改了检测流程和血清学检测操作程序;
———修改了附录A 和附录B。
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 冰箱:2℃~5℃。
2.2 恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 电子天平:感量0.1g。
2.6 无菌锥形瓶:容量500mL,250mL。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.8 无菌培养皿:直径60mm,90mm。
2.9 无菌试管:3mm×50mm、10mm×75mm。
2.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
2.11 全自动微生物生化鉴定系统。
2.12 无菌毛细管。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见A.2。
3.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见A.3。
3.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:见A.4。
3.5 HE琼脂:见A.5。
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见A.6。
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 三糖铁(TSI)琼脂:见A.7。
3.9 蛋白胨水、靛基质试剂:见A.8。
3.10 尿素琼脂(pH7.2):见A.9。
3.11 氰化钾(KCN)培养基:见A.10。
3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.11。
3.13 糖发酵管:见A.12。
3.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见A.13。
3.15 半固体琼脂:见A.14。
3.16 丙二酸钠培养基:见A.15。
3.17 沙门氏菌O、H 和Vi诊断血清。
3.18 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图1。
5 操作步骤
5.1 预增菌
无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW 的无菌均质杯或合适容器内,以8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,用1mol/mL 无菌NaOH 或HCl调pH 至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。
5.3 分离
分别用直径3mm的接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36 ℃±1 ℃培养18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h,以备必要时复查。
5.4.2.1 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
5.4.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号A3:补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 检查培养物有无自凝性
一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻摇动30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自凝性,反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。
5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm 的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O 血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如
2%~3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O 凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定
操作同5.5.2。H 抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,待菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~2次,自远端取菌培养后再检查。
5.6 血清学分型(选做项目)
5.6.1 O 抗原的鉴定
用A~F多价O 血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株,不能分型。
被A~F多价O 血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验。
根据试验结果,判定O 群。被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验,判定E1、E4各亚群,每一个O 抗原成分的最后确定均应根据O 单因子血清的检查结果,没有O单因子血清的要用两个O 复合因子血清进行核对。
不被A~F多价O 血清凝集者,先用9种多价O 血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O 群血清逐一检查,以确定O 群。每种多价O 血清所包括的O 因子如下:
O 多价1 A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)
O 多价2 13,16,17,18,21群
O 多价3 28,30,35,38,39群
O 多价4 40,41,42,43群
O 多价5 44,45,47,48群
O 多价6 50,51,52,53群
O 多价7 55,56,57,58群
O 多价8 59,60,61,62群
O 多价9 63,65,66,67群
5.6.2 H 抗原的鉴定
属于A~F各O 群的常见菌型,依次用表6所述H 因子血清检查第1相和第2相的H 抗原。
不常见的菌型,先用8种多价H 血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血清所包括的各种H 因子血清逐一检查,以第1相和第2项的H 抗原。8种多价H 血清所包括的H 因子如下:
H 多价1 a,b,c,d,i
H 多价2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H 多价3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H 多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H 多价5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H 多价6 z39,z41,z42,z44
H 多价7 z52,z53,z54,z55
H 多价8 z56,z57,z60,z61,z62
每一个H 抗原成分的最后确定均应根据H 单因子血清的检查结果,没有H 单因子血清的要用两个H 复合因子血清进行核对。
检出第1相H 抗原而未检出第2相H 抗原的或检出第2相H 抗原而未检出第1相H 抗原的,可在琼脂斜面上移种1代~2代后再检查。如仍只检出一个相的H 抗原,要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下:
简易平板法:将0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
小玻管法:将半固体管(每管约1mL~2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃,取已知相的H 因子血清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内,待凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。
培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1∶200~1∶800的量加入。
小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50℃,挑取因子血清1环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,待凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,于36℃培养后再做凝集试验。
5.6.3 Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。
5.6.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果,按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠5.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水) 9.0g
磷酸二氢钾1.5g
蒸馏水1000mL
A.1.2 制法
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH 至7.2±0.2,高压灭菌121℃,15min。
A.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
A.2.1 基础液
蛋白胨 10.0g
牛肉膏5.0g
氯化钠3.0g
碳酸钙45.0g
蒸馏水1000mL
除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH 至7.0±0.2,高压灭菌121℃,20min。
A.2.2 硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠(含5个结晶水) 50.0g
蒸馏水加至100mL
高压灭菌121℃,20min。
A.2.3 碘溶液
碘 片20.0g
碘化钾25.0g
蒸馏水加至100mL
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。
A.2.4 0.5%煌绿水溶液
煌绿0.5g
蒸馏水100mL
溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。
A.2.5 牛胆盐溶液
牛胆盐 10.0g
蒸馏水100mL
加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121℃,20min。
A.2.6 制法
基础液 900mL
硫代硫酸钠溶液100mL
碘溶液20.0mL
煌绿水溶液2.0mL
牛胆盐溶液50.0mL
临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种成分。
A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨 5.0g
乳糖4.0g
磷酸氢二钠10.0g
亚硒酸氢钠4.0g
L-胱氨酸0.01g
蒸馏水1000mL
A.3.2 制法
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55℃以下,以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液15mL,使溶解,再加无菌蒸馏水至100mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH 至7.0±0.2。
A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏5.0g
葡萄糖5.0g
硫酸亚铁0.3g
磷酸氢二钠4.0g
煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL
柠檬酸铋铵2.0g
亚硫酸钠6.0g
琼脂18.0g~20.0g
蒸馏水1000mL
A.4.2 制法
将前三种成分加入300mL蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中,琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至80℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。
将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH 至7.5±0.2,随即倾入琼脂液中,混合均匀,冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48h会降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.5 HE 琼脂(HektoenEntericAgar)
A.5.1 成分
蛋白胨 12.0g
牛肉膏3.0g
乳糖12.0g
蔗糖12.0g
水杨素2.0g
胆盐20.0g
氯化钠5.0g
琼脂18.0g~20.0g
蒸馏水1000mL
0.4%溴麝香草酚蓝溶液16.0mL
Andrade指示剂20.0mL
甲液20.0mL
乙液20.0mL
A.5.2 制法
将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH 至7.5±0.2。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠 34.0g
柠檬酸铁铵4.0g
蒸馏水100mL
③乙液的配制
去氧胆酸钠 10.0g
蒸馏水100mL
④Andrade 指示剂
酸性复红 0.5g
1mol/L氢氧化钠溶液16.0mL
蒸馏水100mL
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1mL~2mL。
A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
A.6.1 成分
酵母膏 3.0g
L-赖氨酸5.0g
木糖3.75g
乳糖7.5g
蔗糖7.5g
去氧胆酸钠2.5g
柠檬酸铁铵0.8g
硫代硫酸钠6.8g
氯化钠5.0g
琼脂15.0g
酚红0.08g
蒸馏水1000mL
A.6.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.4±0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.7 三糖铁(TSI)琼脂
A.7.1 成分
蛋白胨 20.0g
牛肉膏5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖1.0g
硫酸亚铁铵(含6个结晶水) 0.2g
酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0mL
氯化钠5.0g
硫代硫酸钠0.2g
琼脂12.0g
蒸馏水1000mL
GB4789.4—2016
1 2
A.7.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.4±0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约2mL~4mL,高压灭菌121 ℃10min或115℃15min,灭菌后制成高层斜面,呈桔红色。
A.8 蛋白胨水、靛基质试剂
A.8.1 蛋白胨水
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0g
氯化钠5.0g
蒸馏水1000mL
将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.4±0.2,分装小试管,121℃高压灭菌15min。
A.8.2 靛基质试剂
A.8.2.1 柯凡克试剂:将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。
A.8.2.2 欧-波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95% 乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。
A.8.3 试验方法
挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d~2d,必要时可培养4d~5d。加入柯凡克试剂约0.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5mL,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。
A.9 尿素琼脂(pH7.2)
A.9.1 成分
蛋白胨 1.0g
氯化钠5.0g
葡萄糖1.0g
磷酸二氢钾2.0g
0.4%酚红3.0mL
琼脂20.0g
蒸馏水1000mL
20%尿素溶液100mL
A.9.2 制法
除尿素、琼脂和酚红外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH 至7.2±0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂后分装,121 ℃高压灭菌15min。冷至50 ℃~55 ℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%。分装于无菌试管内,放成斜面备用。
A.9.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
A.10 氰化钾(KCN)培养基
A.10.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠5.0g
磷酸二氢钾0.225g
磷酸氢二钠5.64g
蒸馏水1000mL
0.5%氰化钾20.0mL
A.10.2 制法
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后121 ℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为1∶10000),分装于无菌试管内,每管约4mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
A.10.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36℃±1℃培养1d~2d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)。
注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。
A.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基
A.11.1 成分
蛋白胨 5.0g
酵母浸膏3.0g
葡萄糖1.0g
蒸馏水1000mL
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0mL
L-赖氨酸或DL-赖氨酸0.5g/100mL或1.0g/100mL
A.11.2 制法
除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5%加入,DL-赖氨酸按1%加入。调节pH 至6.8±0.2。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内,每管0.5mL,上面滴加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。
A.11.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36℃±1 ℃培养18h~24h,观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。
A.12 糖发酵管
A.12.1 成分
牛肉膏 5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠3.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水) 2.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0mL
蒸馏水1000mL
A.12.2 制法
A.12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后,调节pH 至7.4±0.2。按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min。
A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内,以无菌操作分装小试管。
注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
A.12.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36℃±1℃培养,一般2d~3d。迟缓反应需观察14d~30d。
A.13 邻硝基酚β-D 半乳糖苷(ONPG)培养基
A.13.1 成分
邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)
(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)
60.0mg
0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10.0mL
1%蛋白胨水(pH7.5) 30.0mL
A.13.2 制法
将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于无菌的小试管内,每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。
A.13.3 试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36℃±1℃培养1h~3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生,则于1h~3h变黄色,如无此酶则24h不变色。
A.14 半固体琼脂
A.14.1 成分
牛肉膏 0.3g
蛋白胨1.0g
氯化钠0.5g
琼脂0.35g~0.4g
蒸馏水100mL
A.14.2 制法
按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH 至7.4±0.2。分装小试管。121℃高压灭菌15min。直立凝固备用。
注:供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验等用。
A.15 丙二酸钠培养基
A.15.1 成分
酵母浸膏 1.0g
硫酸铵2.0g
磷酸氢二钾0.6g
磷酸二氢钾0.4g
氯化钠2.0g
丙二酸钠3.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0mL
蒸馏水1000mL
A.15.2 制法
除指示剂以外的成分溶解于水,调节pH 至6.8±0.2,再加入指示剂,分装试管,121 ℃高压灭菌15min。
A.15.3 试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种,于36℃±1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。
附 录 B
常见沙门氏菌抗原
常见沙门氏菌抗原见表B.1。
