细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是β-半乳糖苷酶渗透酶，它位于细胞膜上，可送乳糖分子渗入细胞，另一种β-半乳糖苷酶，亦称乳糖酶，位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。
具有上述两种酶的细菌，能在24-48h发酵乳糖，而缺乏此两种酶的细菌，不能分解乳糖。乳糖迟缓发酵菌只有β-半乳糖苷酶（胞内酶）而缺乏β-半乳糖苷渗透酶，因而乳糖进入细胞很慢，需经培养基中1%乳糖较长时间的诱导，产生相当数量的渗透酶后，才能较快分解乳糖，故呈现迟缓发酵现象。
ONPG可迅速进入细菌细胞，被β-半乳糖苷酶水解，释放出黄色的邻位硝基苯酚（ONP），故而培养基变黄可迅速测知β-半乳糖苷酶的存在。当细菌为迟缓发酵乳糖时，其分解乳糖的时间非常长，常需连续监测3-7天；而培养基中加入ONPG后，迟缓发酵乳糖的细菌也可在非常短的时间内监测到，常在2-16h内可以得到阳性结果。
因此，用含有ONPG的培养基可以快速鉴定乳糖迟缓发酵菌。
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