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GBT 4789.41-2016 肠杆菌科检验



录入时间:2016-9-27 14:05:21 来源:青岛银河澳门官网入口

1 范围
本标准规定了食品中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的检验方法。
本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数。
2 术语和定义
2.1
肠杆菌科 
在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2
肠杆菌科计数 
按本标准规定方法,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。
2.3
最可能数 
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。
3.3 水浴箱:46 ℃±1 ℃。
3.4 天平:感量0.1g。
3.5 显微镜:10倍~100倍。
3.6 均质器。
3.7 振荡器。
3.8 无菌吸管:1mL(具0.01mL 刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3.9 无菌锥形瓶或等效容器:容量150mL、500mL。
3.10 无菌培养皿:直径90mm。
3.11 无菌试管:18mm×180mm、15mm×150mm。
3.12 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
4 培养基和试剂
4.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见B.1。
4.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE 肉汤):见B.2。
4.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA):见B.3。
4.4 营养琼脂(NA):见B.4。
4.5 葡萄糖琼脂:见B.5。
4.6 革兰氏染色液:见B.6。
4.7 氧化酶试剂:见B.7。
4.8 无菌1mol/LNaOH:见B.8。
4.9 无菌1mol/L HCl:见B.9。
第一法 肠杆菌科平板计数法
5 检验程序
肠杆菌科平板计数法检验程序见图1。


6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品:称取25g 样品放入盛有225 mLBPW 的无菌均质杯中,8000r/min~10000r/min均质1 min~2min,或放入盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。
6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL 样品放入盛有225mLBPW 的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。
6.1.3 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入盛有9mLBPW 的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1 mL 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
6.1.4 按6.1.3操作程序,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
6.2 倾注平板和培养
6.2.1 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1mLBPW 加入两个无菌平皿内作为空白对照。
6.2.2 将10mL~15mL 冷却至46 ℃的VRBGA(可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,使样品匀液与培养基充分混匀。
6.2.3 待琼脂凝固后,倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为
明显。
6.2.4 待VRBGA 平板上层琼脂凝固后翻转平板,36 ℃±1 ℃培养18h~24h。
6.3 典型菌落计数和确认
6.3.1 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在15CFU~150CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位(CFU)表示。
6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
6.3.4 从每个平板上至少挑取5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。
6.3.5 典型菌落的确认:
a) 分别将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,36 ℃±1 ℃培养18h~24h,挑取平板上的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。
b) 革兰氏染色镜检:肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,大小为(0.3~1.0)μm× (1.0~6.0)μm。
c) 氧化酶试验:用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂的滤纸上,滤纸的颜色在10s内变成蓝紫色,判为阳性反应。
d) 葡萄糖发酵试验:用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落,穿刺于葡萄糖琼脂内,于36 ℃±
1 ℃培养24h±2h,若试管内的内容物变为黄色,判为阳性反应。
6.4 结果的计算
6.4.1 一般原则
若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内,按式(1)计算,示例见A.1、A.2、A.3、A.4。


 式中:
N———样品中肠杆菌科菌落数;
Σa———确证的肠杆菌科菌落数之和;
n1 ———第一稀释度(低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);
n2 ———第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);
d———稀释因子(第一稀释度)。
其中,a按式(2)计算:


 式中:
a———确证的肠杆菌科菌落数;
b———某一平板中犃个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数,b≤A;
A———某一平板中用于确认试验的菌落数;
C———某一平板中典型菌落总数。
6.4.2 低菌落数
若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于15CFU,具有确证的肠杆菌科菌落,
则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。
若最低稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,或典型菌落数均小于15CFU,且无确证的
肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6.4.3 特殊情况
第一稀释度平板上的典型菌落数均大于150CFU,且有确证的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU 之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算,示例见A.5。
若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
7 报告
7.1 菌落数小于100时,以整数报告。
7.2 菌落数大于或等于100时,对第3位数字进行修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,采用两位有效数字。
7.3 数字修约按“四舍五入”原则进行。
7.4 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。
7.5 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
7.6 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL 为单位报告。
第二法 肠杆菌科犕犘犖计数法
8 检验程序
肠杆菌科MPN 计数法检验程序见图2。

 

9 操作步骤
9.1 样品的稀释
按6.1进行。
9.2 接种和培养
9.2.1 非选择性前增菌
根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择3 个适宜连续稀释度的样品匀液,每个稀释度3管,共9管BPW 于36 ℃ ±1 ℃培养18h±2h。
9.2.2 选择性增菌
从BPW 各培养管中,分别移取1mL 培养物,接种于10mL 的EE 肉汤中,36℃±1℃培养24h±2h。
9.2.3 分离
用接种环从EE 各肉汤管中分别取培养物1环,划线接种于VRBGA 平板,36 ℃±1 ℃培养24h±2h,观察平板上有无典型菌落。
9.3 典型菌落的确认
典型菌落确认见6.3。
10 报告
肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有1个菌落确认为肠杆菌科,其所代表的EE 管即为肠杆菌科阳性,依据EE 阳性管数查MPN 表(见附录C),报告每克(毫升)样品中肠杆菌科的MPN 值。称重取样以MPN/g为单位报告,体积取样以MPN/mL 为单位报告。

实验所需产品一览表(点击产品名称即可进入产品详情页面:

 产品货号  产品名称  规格(g)   价格(元)  产品说明及用途
 HB0109  营养琼脂(NA)  250g      90            细菌计数、不含糖,可作血琼脂基础和传代用(GB标准)
 HB4084  缓冲蛋白胨水(BPW)  250g  70  用于阪崎杆菌前增菌培养(GB标准)
 HB0126-7  缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤)  250g  250  每支添加于200ml
 HB0176-4  结晶紫中性红胆盐葡萄糖肉汤(VRBGA)  250g  105  用于分离小肠结肠炎耶尔森氏菌
 HB0135-2     葡萄糖琼脂  250g  120  用于小肠结肠炎耶尔森氏菌增菌培养
 HB8278  革兰氏染色液  5ml*8          40  生化培养基,用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化反应筛选
 JX3400094       氧化酶试剂  1g  50  生化培养基,用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化反应筛选


 

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