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双歧杆菌检验(征求意见稿)



录入时间:2016-4-13 16:14:17 来源:青岛银河澳门官网入口

1  范围

本标准规定了食品用双歧杆菌(Bifidobacterium)的鉴定及计数方法。

本标准适用于食品双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一的双歧杆菌菌种的鉴定;以及食品中仅含有双歧杆菌属的计数,双歧杆菌属可包含一种或多种不同的双歧杆菌菌种。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1  恒温培养箱:36 ±1 。

2.2  冰箱:2 5 。

2.3  天平:感量0.1 g。

2.4  无菌试管:18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

2.5  无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及配套吸头。

2.6  无菌培养皿:直径90 mm。

3  培养基和试剂

3.1  双歧杆菌培养基:见附录A.1。

3.2  PYG培养基:见附录A.2。

3.3  甲醇:分析纯。

3.4  三氯甲烷:分析纯。

3.5  冰乙酸:分析纯。

3.6  乳酸:分析纯。

3.7  乙酸标准溶液:吸取分析纯冰乙酸5.7 mL,移入100 mL容量瓶中,加水至刻度,标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1 mol/L。

3.8  乳酸标准溶液:吸取分析纯乳酸8.4 mL,移入100 mL容量瓶中,加水至刻度,标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1 mol/L。


4  检验程序

双歧杆菌的检验程序见图1。

1  双歧杆菌的检验程序

5  操作步骤

5.1  无菌要求:全部操作均应遵循无菌操作程序。

5.2  食品用双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数

5.2.1  鉴定

5.2.1.1  接种:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板。真空冷冻干燥菌种,先加适量灭菌生理盐水,溶解菌粉,然后接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ±1 厌氧培养48 h±2 h。

5.2.1.2  涂片镜检:双歧杆菌为革兰氏染色阳性,不抗酸、无芽孢、无动力,菌体形态多样,呈短杆状、纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉形态。

5.2.1.3  生化鉴定:挑取5.2.1.1步骤中的平板上生长的单个菌落,进行生化反应检测。双歧杆菌的过氧化氢酶试验为阴性。不同双歧杆菌菌种主要生化反应见表1。

5.2.1.4  气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录B.1。

5.2.2  计数

5.2.2.1  样品的稀释

5.2.2.2.1  1.0 g固体菌种9.0 mL生理盐水或其它稀释液,制成1:10的样品匀液。

5.2.2.2.2  1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0 mL,沿管壁缓慢注于装有9.0 mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。

5.2.2.2.3  另取1 mL无菌吸管或吸头,按5.2.2.2.1操作程序,制备10系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,即换用11 mL灭菌吸管或吸头。

5.2.2.2.4  根据对样品双歧杆菌浓度的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸取1.0 mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1.0 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

5.2.2.2.5  及时将 15 mL20 mL冷却至 46 双歧杆菌琼脂培养基(可放置于46 ±1 恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。

5.2.2.2  培养

待琼脂凝固后,将平板翻转,36 ±1 厌氧培养48 h±2 h。

5.2.2.3  菌落计数

可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落

形成单位(colony-forming units,CFU)表示。

5.2.2.3.1  选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数,大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

5.2.2.3.2  其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。

5.2.2.3.3  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。

5.3  食品中双歧杆菌的鉴定及计数

5.3.1  鉴定

5.3.1.1  称重取样25.0 g,或体积取样25.0 mL,置于装有225 mL稀释液的灭菌锥形瓶内,制成1:10的样品匀液。

5.3.1.2  上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ℃±1 厌氧培养48 h±2 h。

5.3.1.3  纯培养

挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板。平板在36 ±1 厌氧培养48 h±2 h。

5.3.1.4  涂片镜检:参照5.2.1.2。

5.3.1.5  生化鉴定:参照5.2.1.3。

5.3.1.6  气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物,参照5.2.1.4。

5.3.2  计数

5.3.2.1  5.3.1.1步。

5.3.2.2  稀释步骤  参照5.2.2.1。

5.3.2.3  菌落计数  参照5.2.2.3。

6  报告

6.1  鉴定

根据5.2.1.2项镜检、5.2.1.3项生化鉴定,报告双歧杆菌属的种名。根据5.2.1.4乙酸与乳酸微摩尔之比,报告双歧杆菌有机酸代谢产物。

6.2  计数

6.2.1  菌落计数的计算方法和报告:参照GB 4789.2《食品微生物学检验 菌落总数测定》中的7.17.2。

6.2.2  称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。

 

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