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单核细胞增生李斯特氏菌检验(征求意见稿)(二)



录入时间:2016-3-30 15:49:08 来源:青岛银河澳门官网入口

  单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法

6.  检验程序

7  操作步骤

7.1 样品稀释

7.1.1 以无菌操作称取样品25g(mL),放入盛有225 mL 缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌均质(或均质杯)内,连续均质1 min~2 min以8000 r/min~10000 r/min均质1 min~2 min。液体样品,振荡混匀,制成1:10的样品匀液。

7.1.2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓慢注于盛有9 mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100 的样品匀液。

7.1.3 7.1.2 操作程序,制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用 1 1 mL 无菌吸管或吸头。

7.2 样品接种

根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度样品匀液分别吸取1 mL0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量分别加入3块李斯特氏菌显色(或ALOA)平板中,用无菌L 棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在25 ~50 的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。

7.3 培养

7.3.1 在通常情况下,涂布后,将平板静置10 min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36 ±1 培养1 h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36 ±1 ℃培养24h48h。

7.4 典型菌落计数和确认

7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌ALOA平板上为蓝绿色菌落,周围有不透明晕圈;其他李斯特氏菌显色平板菌落特征以产品说明为准。

7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在15 CFU~150 CFU之间的平板,计数典型菌落数。如果:

a)只有一个稀释度的平板菌落数在15CFU~150CFU之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;

b)所有稀释度的平板菌落数均小于15 CFU且有典型菌落,应计数最低稀释度平板上的典型菌落;

c)某一稀释度的平板菌落数大于150 CFU 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;

d)所有稀释度的平板菌落数大于150 CFU 且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;

e)所有稀释度的平板菌落数均不在15 CFU~150 CFU 之间且有典型菌落,其中一部分小于15 CFU 或大于150CFU 时,应计数最接近15CFU 或150 CFU的稀释度平板上的典型菌落。

以上按公式(1)计算。

f)2 个连续稀释度的平板菌落数均在15CFU~150 CFU 之间,按公式(2)计算。

7.4.3 从典型菌落中任选5 个菌落(小于5 个全选),分别按5.3、5.4或5.5进行鉴定和确认试验。 

8.结果计数

公式(1):

 

式中:

T——样品中单核细胞增生李斯特氏菌落数;

A——某一稀释度典型菌落的总数;

B——某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;

C——某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;

d——稀释因子。

公式(2):

 

式中:

T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;

A1——第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;

A2——第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;

B1——第一稀释度(低稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;

B2——第二稀释度(高稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;

C1——第一稀释度(低稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;

C2——第二稀释度(高稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;

1.1——计算系数;

d ——稀释因子(第一稀释度)。

9.结果报告

报告每g(mL)样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数,以CFU/g(mL)表示;如T值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

 

 

 单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法

10 检验程序

11.操作步骤

11.1 样品的稀释

7.1进行。

11.2接种和培养

11.2.1根据对样品污染状况的估计,3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10 mLLB1肉汤,每一稀释度接种3管,每管接种1 mL(如果接种量需要超过1 mL,则用双料LB1增菌液30 ±1 培养24 h±2 h。每管各移取0.1 mL,转种于10 mL LB2增菌液内,30 ±1 培养24±2 h。

11.2.2 用接种环从各管中移取1环,分别接种李斯特氏菌显色(或ALOA)平板,36 ±1 培养24 h~48 h。

11.3 确证试验

自每块平板上挑取5个典型菌落(5个以下全选),按照5.3、5.4或5.5进行鉴定。

12  结果与报告

根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数,查MPN检索表(见附录B),报告每gmL)样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数,以MPN/gmL)表示。

附录A

(规范性附录)

培养基和试剂

A.1  含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)

A.1.1  成分

      胰胨                                                17.0 g

      多价胨                                              3.0 g

      酵母膏                                              6.0 g

      氯化钠                                              5.0 g

      磷酸氢二钾                                          2.5 g

      葡萄糖                                              2.5 g

      蒸馏水                                              1 000 mL

      pH 7.27.4

A.1.2  制法

将上述各成分加热搅拌溶解,调节pH,分装,121 高压灭菌15 min,备用。

A.2  0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)

A.2.1  成分

      胰胨                                               17.0 g

      多价胨                                             3.0 g

      酵母膏                                             6.0 g

      氯化钠                                             5.0 g

      磷酸氢二钾                                         2.5 g   

      葡萄糖                                             2.5 g

      琼脂                                               15.0 g

      蒸馏水                                             1 000 mL

pH 7.27.4

A.2.2  制法

    将上述各成分加热搅拌溶解,调节pH,分装,121 高压灭菌15 min,备用。

A.3  李氏增菌肉汤(LB1,LB2)

A.3.1  成分

      胰胨                                               5.0 g  

      多价胨                                             5.0 g

      酵母膏                                             5.0 g

      氯化钠                                             20.0 g

      磷酸二氢钾                                         1.4 g

      磷酸氢二钠                                         12.0 g

      七叶苷                                             1.0 g

      蒸馏水                                             1 000 mL

pH 7.27.4

A.3.2  制法

    将上述成分加热溶解,调节pH,分装,121 高压灭菌15 min,备用。

A.3.2.1  李氏 (LB1)225 mL中加入:

      1 % 萘啶酮酸 (0.05 mol/L氢氧化钠溶液配制)      0.5 mL

      1 % 啶黄 (用无菌蒸馏水配制)                    0.3 mL

A.3.2.2  李氏 (LB2)200 mL中加入:

      1 % 萘啶酮酸                                     0.4 mL

      1 %啶黄                                        0.5 mL

A.4  PALCAM琼脂

A.4.1  成分

      酵母膏                                          8.0 g

      葡萄糖                                          0.5 g

      七叶甙                                          0.8 g

      柠檬酸铁铵                                      0.5 g

      甘露醇                                          10.0 g

      酚红                                            0.1 g

      氯化锂                                          15.0 g

酪蛋白胰酶消化物                                10.0 g

心胰酶消化物                                    3.0 g

玉米淀粉                                        1.0 g

      肉胃酶消化物                                    5.0 g

氯化钠                                          5.0 g

琼脂                                            15.0 g

      蒸馏水                                          1 000 mL

pH 7.27.4

A.4.2  制法                         

    将上述成分加热溶解,调节pH,分装,121 高压灭菌15 min,备用。

A.4.2.1  PALCAM选择性添加剂

      多粘菌素B                                      5.0 mg

      盐酸吖啶黄                                      2.5 mg

      头孢他啶                                        10.0 mg

      无菌蒸馏水                                      500 mL

A.4.2.2  制法

    PALCAM基础培养基溶化后冷却到50 ,加入2 ml PALCAM选择性添加剂,混匀后倾倒在无菌的平皿中,备用。

A.5  ALOAAgar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA)琼脂

A.5.1 基础培养基

A.5.1.1  成分

动物组织的酶消化物                              18 g

酪蛋白胰酶消化物                                6 g

酵母提取物                                      10 g

丙酮酸钠                                        2 g

葡萄糖                                          2 g

甘油磷酸镁                                      1 g

无水硫酸镁                                      0.5 g

氯化钠                                             5 g

氯化锂                                             10 g

无水磷酸氢钠                                       2.5 g

5 -- 4 --3吲哚-β-D吡喃葡萄糖苷                0.05 g

琼脂                                               12 g18 g(a)

蒸馏水                                             930 ml b

a 按琼脂强度确定

b 如果用两性霉素B925ml蒸馏水(见A.5.5.2).

A.5.1.2  制法

上述成分进行加热溶解,调pH7.2 ± 0.2,121°C 高压灭菌15min。

A.5.2 萘啶酮酸溶液

萘啶酮酸钠盐                                             0.02 g

0.05mol/l的氢氧化钠                                       5 ml

溶解萘啶酮酸钠于5ml氢氧化钠溶液中,通过0.45μm膜过滤,4°C保存备用。

A.5.3 头孢他啶溶液

头孢他啶                                                0.02 g

无菌蒸馏水                                              5 ml

溶解头孢他啶于5ml无菌蒸馏水中,通过0.45μm膜过滤,4°C保存备用。

A.5.4 多粘菌素B

多粘菌素B硫酸盐                                           76700 IU

无菌蒸馏水                                                 5 ml

溶解多粘菌素B5ml无菌蒸馏水中,通过0.45μm膜过滤,4°C保存备用。

A.5.5 抗生素添加剂

A.5.5.1 放线菌酮溶液

放线菌酮                                                  0.05 g

乙醇                                                      2.5 ml

无菌蒸馏水                                                2.5 ml

溶解放线菌酮于2.5ml乙醇溶液中,然后加入2.5ml无菌蒸馏水混匀。通过0.45μm膜过滤,4°C保存备用。

A.5.5.2  两性霉素B溶液(可以替代放线菌酮溶液)

两性霉素B                                                   0.01 g

1 mol/l 盐酸(HCl (1 mol/l))                                   2.5 ml

二甲基甲酰胺(DMF))                                         7.5 ml

溶解两性霉素在盐酸/二甲基甲酰胺溶液中,通过0.45μm膜过滤,4°C保存备用。

注意---盐酸/二甲基甲酰胺溶液有毒,小心使用。

A.5.6  补充剂

溶解2g L-α-磷脂酰肌醇50 ml蒸馏水中,搅拌30min制成均匀悬浮液。121°C 高压灭菌15min。冷却至48°C50°C,4°C保存备用。

A.5.7  完全培养基

A.5.7. 1成分

基础培养基                                                 930 ml(a)

萘啶酮酸钠溶液                                             5 ml

头孢他啶溶液                                               5 ml

多粘菌素B溶液                                             5 ml

放线菌酮溶液                                               5 ml

或两性霉素B溶液                                           10 ml

补充剂                                                    50 ml

a 如果使用两性霉素B溶液就需要925ml

A.5.7.2 制法

将基础培养基完全溶解,冷却到50 ,加入上述各种溶液,混匀后倾倒在无菌的平皿中,备用。完全培养基的pH值应为7.2 ± 0.2。

A.6  革兰氏染色液

A 6.1  结晶紫染色液

A.6.1.1  成分

结晶紫

1.0 g

95%乙醇

20.0 mL

1%草酸铵水溶液

80.0 mL

A 6.1.2  制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。

A 6.2  革兰氏碘液

A.6.2.1  成分

1.0 g

碘化钾

2.0 g

蒸馏水

300 mL

A.6.2.2  制法

将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300 mL。

A.6.3  沙黄复染液

A.6.3.1  成分

沙黄

0.25 g

95%乙醇

10.0 mL

蒸馏水

90.0 mL

A.6.3.2  制法

将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。

A.6.4  染色法

A.6.4.1  涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液,作用1min, 水洗。

A.6.4.2  滴加革兰氏碘液,作用1 min,水洗。

A.6.4.3  滴加95%乙醇脱色,约15 s30 s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。

A.6.4.4  滴加复染液,复染1 min,水洗、待干、镜检。

A.7  SIM 动力培养基 

A 7.1  成分

      胰胨                                                  20.0 g

      多价胨                                                6.0 g

      硫酸铁铵                                              0.2 g

      硫代硫酸钠                                            0.2 g

      琼脂                                                  3.5 g

      蒸馏水                                                1 000 mL

      pH 7.2

A.7.2  制法

将上述各成分加热混匀,调节pH,分装小试管,121 高压灭菌15 min,备用。

A.7.3  试验方法

    挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中,于30 培养24 h48 h,观察结果。

A.8  缓冲葡萄糖蛋白胨水(MRVP试验用)

A.8.1  成分

     多胨                                                 7.0 g

     葡萄糖                                               5.0 g

磷酸氢二钾                                           5.0 g

     蒸馏水                                               1 000 mL

A.1.1.1      pH 7.0成分

A.8.2  制法

    溶化后调节pH,分装试管,每管1 mL,121 高压灭菌15 min,备用。

A.8.3  甲基红(MR)试验

A.8.3.1  甲基红试剂

A.8.3.1.1  成分

甲基红

10 mg

95 %乙醇

30 mL

蒸馏水

20 mL

A.8.3.1.2  制法

10 mg甲基红溶于30 mL 95 %乙醇中,然后加入20 mL蒸馏水。

A.8.3.1.3  试验方法

取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白冻水中,36 ±1 培养2 d5 d。滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果。鲜红色为阳性,黄色为阴性。 

A.8.4  V-P试验

A.8.4.1  6 % α-萘酚-乙醇溶液

成分及制法:取α-萘酚6.0 g,加无水乙醇溶解,定容至100 mL。

A.8.4.2  40 %氢氧化钾溶液

成分及制法:取氢氧化钾40 g,加蒸馏水溶解,定容至100 mL。

A.8.4.3  试验方法

取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白冻水中,36 ±1 培养2 d4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL40 %氢氧化钾溶液0.2 mL,充分振摇试管,观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36 ±1 继续培养1 h再进行观察。

A.9  血琼脂

A.9.1  成分

蛋白胨                                               1.0 g
  牛肉膏                                               0.3 g
  氯化钠                                               0.5 g
  琼脂                                                 1.5 g
  蒸馏水                                               100 mL

    脱纤维羊血                                           5 mL8 mL

A 9.2  制法 

    除新鲜脱纤维羊血外,加热溶化上述各组分,121 ℃高压灭菌15 min,冷到50 ℃,以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血,摇匀,倾注平板。

A.10  糖发酵管

A.10.1  成分

    牛肉膏                                               5.0 g

    蛋白胨                                               10.0 g

    氯化钠                                               3.0 g

    磷酸氢二钠(Na2HPO4×12H2O)                            2.0 g

    0.2%溴麝香草酚蓝溶液                                 12.0 mL

    蒸馏水                                               1 000 mL

A.10.2  制法

A.10.2.1  葡萄糖发酵管按上述成分配好后,按0.5 %比例加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,调节pH7.4,115 高压灭菌15 min,备用。

A.10.2.2  其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100 mL,115 高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内,以无菌操作分装小试管。

A.10.3  试验方法

    取适量纯培养物接种于糖发酵管,36 ±1 培养24 h48 h,观察结果,蓝色为阴性,黄色为阳性。

A.11  过氧化氢酶试验

A.11.1  试剂

    3%过氧化氢溶液:临用时配制。

A.11.2  试验方法

    用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净试管内,,滴加3%过氧化氢溶液2 mL,观察结果。

A.11.3  结果

    于半分钟内发生气泡者为阳性,不发生气泡者为阴性。

A.12. 缓冲蛋白胨水(BPW)

A.12.1成分

蛋白胨                                             10.0g

氯化钠                                             5.0 g

磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)                         9.0 g

磷酸二氢钾                                         1.5 g

蒸馏水                                             1 000 mL

pH 7.2

A.12.2. 制法

加热搅拌至溶解,调节pH,121 ℃高压灭菌15 min。


附录B

(规范性附录)

单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN)检索表

B.1 g(mL)检样中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN

 

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