一、实验目的和内容
目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。
内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。
2．用紫外线进行诱变处理。
3．用平板透明圈法进行两次初筛。
4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。
二、实验材料和用具
米曲霉斜面菌种；
豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白；
三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。
三、操作步骤
(一)出发菌株的选择及菌悬液制备
1．出发菌株的选择 可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌悬液制备 取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108个/mL，冷冻保藏备用。
(二)诱变处理
用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1．紫外线处理 打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2．稀释菌悬液 按10倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。
(三)优良菌株的筛选
1. 初筛 首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50个，作为复筛菌株。
2．平板复筛 分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8等份，1～7份中点种初筛菌株，第8份点种原始菌株，作为对照。培养48h后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。
3．摇瓶复筛 将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，豆饼粉(或面粉)15g，加水95～110mL(称为润水)，水含量以手捏后指缝有水而不下滴为宜，于500mL三角瓶中装入15～20g(料厚为1～1.5cm)，121℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24～48h，共培养3～5d后检测蛋白酶活性。
4．蛋白酶的测定方法
(1)取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100mL，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测定酶活性。另取lg培养物于105℃烘干测定含水量。
(2)酶活性测定：30℃ pH7.5条件下水解酪蛋白(底物为0.5%酪蛋白)，每分钟产酪氨酸1μg为一个酶活力单位。计算公式为：
(A样品OD680nm值-A对照OD680nm值)×K×V/t×N
K：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数；
V：酶促反应的总体积；
t： 酶促反应时间(min)；
N：酶的稀释倍数。
5．谷氨酸的检测 此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。
检测培养基：豆饼粉：麸夫=6：4，润水75%，121℃湿热灭菌30min。
谷氨酸测定：于以上培养基中加入7%盐水(W/V)，40～45℃水浴，水解9d后过滤，以滤液检测谷氨酸含量(测压法)。
四、注意事项
1. 紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。
2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。
五、实验报告
1. 试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。
2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？
六、问题和思考
1．试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。
2．为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？
注：筛选菌株数的计算 若按突变率为0.01计算，则一次筛选可取250—300个菌落，第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其最适量可参考以下计算方法：如初筛菌株数为200株，二次筛选欲选株数为2株，则二级应选(200×2)1/2，为20株，这样的数量选择，使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。
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