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食品微生物学检验 沙门氏菌检验



录入时间:2016-2-1 14:33:42 来源:青岛银河澳门官网入口

000011 范围

本标准规定了食品中沙门氏菌Salmonella的检验方法。

本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1  冰箱:。

2.2  恒温培养箱:36 ±1 ,42 ±1 ℃。

2.3  均质器。

2.4  振荡器。

2.5  电子天平:感量0.1 g。

2.6  无菌锥形瓶:容量500 mL,250 mL。

2.7  无菌带螺旋帽广口瓶:容量500 mL。

2.8  无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及吸头。

2.9  无菌培养皿:直径60mm,90 mm。

2.10  无菌试管:3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。

2.11  无菌毛细管。

2.12  pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.13  全自动微生物生化鉴定系统。

3  培养基和试剂

3.1  缓冲蛋白胨水(BPW):见附录AA.1。

3.2  乳糖肉汤(LB):见附录AA.2。

3.3  胰酪胨大豆肉汤(TSB):见附录AA.3。

3.4  再造脱脂奶粉:见附录AA.4。

3.5  1%煌绿水溶液(BG:见附录AA.5。

3.6  通用前增菌肉汤(UPB:见附录AA.6。

3.7  四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见附录AA.7。

3.8  氯化镁孔雀绿大豆RVS)增菌液:见附录AA.8。

3.9  亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见附录AA.9。

3.10  亚硫酸铋(BS)琼脂:见附录AA.10。

3.11  HE琼脂:见附录AA.11。

3.12  木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见附录AA.12。

3.13  沙门氏菌属显色培养基。

3.14  三糖铁(TSI)琼脂:见附录AA.13。

3.15  蛋白胨水、靛基质试剂:见附录AA.14。

3.16  尿素琼脂(pH 7.2):见附录AA.15。

3.17  氰化钾 KCN 培养基:见附录AA.16。

3.18  赖氨酸脱羧酶试验培养基:见附录AA.17。

3.19  糖发酵管:见附录AA.18。

3.20  邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见附录AA.19。

3.21  半固体琼脂:见附录AA.20。

3.22  丙二酸钠培养基:见附录AA.21。

3.23  沙门氏菌OH诊断血清。

3.24  生化鉴定试剂盒。

4  检验程序

沙门氏菌检验程序见下图。

 

5  操作步骤

5.1  前增菌

5.1.1 解冻和保存样品

检验前冷冻样品最好不要解冻,如果冷冻样品必须软化以取其检测部分,应在45 ℃以下不超过15 min,或℃~℃不超过18 h解冻。若不能及时检验应置于-15 ℃左右保存。非冷冻而易腐的食品,置于4 ℃冰箱保存。

5.1.2 一般样品

无菌操作称取25 gmL)样品,置于盛有225 mL BPW的灭菌均质杯内,以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min,或置于盛有225 mL BPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH值,用1 mol/mL无菌NaOHHClpH6.8±0.2。无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中,如使用均质袋,可直接进行培养,36 ℃±℃培养8 h18 h。

5.1.3 肉制品

无菌操作称取剪碎后的肉类样品25 g,置于灭菌均质杯内,加入25 mL BPW,以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min,移入盛有200 mL BPW500 mL广口瓶或其他合适容器内,混合均匀。如需调整pH值,用1 mol/mL无菌NaOHHClpH6.8±0.2,充分混匀。于36 ℃±℃培养8 h18 h。

5.1.4 即食蛋制品

5.1.4.1 冰蛋品

    按5.1.2进行。

5.1.4.2 干蛋品

无菌操作称取25 g样品置于灭菌的500 mL广口瓶或其他合适容器内,加入225 mL乳糖肉汤。如果制品是粉状,加入约15 mL乳糖肉汤,用灭菌玻璃棒、匙或压舌器搅拌,使呈均匀悬液,再加3份乳糖肉汤10 mL、10 mL、190 mL,使总量为225 mL,充分搅拌,直到样品完全悬浮没有团块为止。盖紧瓶盖在室温下静置60 min,振荡使其充分混匀。如需调整pH值,用1 mol/mL无菌NaOHHClpH6.8±0.2,充分混匀。将瓶盖旋松1/4转,于35 ℃±℃培养24 h±2 h。

5.1.4.3煮硬的蛋

无菌剥离蛋壳,无菌操作压碎蛋白和蛋黄,称取25 g置于灭菌的500 mL锥形瓶或其他合适容器内,加225 mL TSB,并振荡充分混匀。在室温下静置60 min,振荡使其充分混匀。如需调整pH值,用1 mol/mL无菌NaOHHClpH6.8±0.2,充分混匀。将瓶盖旋松1/4转,于35 ℃±℃培养24 h±2 h。

5.1.5 巧克力类及可可制品

无菌操作称取25 g样品置于灭菌的搅拌容器内,加入225 mL再造脱脂奶粉,搅拌2 min。再无菌操作转移搅拌过的混合物到灭菌的带螺旋帽500 mL广口瓶或其他合适容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60 min,转动混匀。如需调整pH值,用1 mol/mL无菌NaOHHClpH6.8±0.2,再加入0.45 mL 1%煌绿水溶液混匀。将瓶盖旋松1/4转,于35 ℃±℃培养24 h±2 h。

5.1.6 即食果蔬制品

5.1.6.1新鲜的、冷冻的或干的水果和蔬菜

无菌操作称取25 g样品置于灭菌的均质器内,加入225 mL乳糖肉汤并均质2 min。再无菌操作转移已均质的混合物到灭菌的带螺旋帽500 mL广口瓶或其他合适容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60 min,转动混匀。如需调整pH值,用1 mol/mL无菌NaOHHClpH6.8±0.2,充分混匀。将瓶盖旋松1/4转,于35 ℃±℃培养24 h±2 h。

5.1.6.2 绿叶蔬菜

无菌操作称取25 g样品,加入灭菌的广口锥形瓶或其他合适容器内,加入225 mL乳糖肉汤,顺时针和逆时针用力振摇锥形瓶各25次,在室温下静置60 min,振摇混合。如需调整pH值,用1 mol/mL无菌NaOHHClpH6.8±0.2,充分混匀。于35 ℃±℃培养24 h±2 h。

5.1.7 坚果籽实制品

5.1.6.1进行。

5.1.8 橙汁、苹果酒和苹果汁等饮料

无菌操作称取25 gmL)样品置于灭菌的带螺旋帽的500 mL广口瓶或其他合适容器内,加入225 mL灭菌通用前增菌肉汤,充分混匀。在室温下静置60 min。不调pH值,于35 ℃±℃培养24 h±2 h。

5.1.9 鱼贝类水产品

5.1.6.1进行。

5.2  增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1 mL,转种于10 mL TTB 内,于42 ±1 培养18 h24 h;乳与乳制品可选择RVS增菌液,移取0.1 mL,转种于10 mL RVS内,于41.5 培养18 h24 h。同时,另取1 mL,转种于10 mL SC内,于36 ±1 培养18 h24 h。

5.3  分离

分别用直径3mm接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),36 ±1 分别培养40 h48 hBS琼脂平板)或18 h24 hXLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。

表 1   沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板  

沙门氏菌  

BS琼脂  

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。

HE琼脂        

蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。

XLD琼脂

菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心。

沙门氏菌属显色培养基

按照显色培养基的说明进行判定。

5.4  生化试验

5.4.1  自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36 ±1 培养18 h24 h,必要时可延长至48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。

表2  沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基

初步判断

斜面

底层

产气

硫化氢

K

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

K

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

A

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

A

A

+/-

+/-

非沙门氏菌

K

K

+/-

+/-

+/-

非沙门氏菌

注:K:产碱,A:产酸;+:阳性,-:阴性;+(-):多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性。

5.4.2  接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 ±1 培养18 h24 h,必要时可延长至48 h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于或室温至少保留24 h,以备必要时复查。

表3  沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号

硫化氢 

H2S)  

靛基质   

pH 7.2尿素   

氰化钾  

KCN

赖氨酸脱羧酶

A1

A2

A3

+/-

注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。

           

5.4.2.1  反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。 如有2项异常为非沙门氏菌。

表4  沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

pH 7.2尿素  

氰化钾(KCN) 

赖氨酸

脱羧酶              

判  定  结  果

甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)

沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)

沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)

注:+表示阳性;+表示阴性。

5.4.2.2  反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。                                  

5.4.2.3  反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

5.4.2.4  必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。


表5  沙门氏菌属各生化群的鉴别

项  目

卫矛醇

山梨醇

水杨苷

ONPG

丙二酸盐

KCN

注:+表示阳性; -表示阴性。

                   

5.4.3  如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 

5.5  血清学鉴定

5.5.1  检查培养物有无自凝性

一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻摇动3060 s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自凝性,反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。

5.5.2  多价菌体抗原(O)鉴定

    在玻片上划出2个约1 cm×2 cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如2%~3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1 mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。

5.5.3  多价鞭毛抗原(H)鉴定

     操作5.5.2。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,俟菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~2次,自远端取菌培养后再检查。

5.5.4  血清学分型(选做项目)

5.5.4.1  O抗原的鉴定

    AF多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株,不能分型。

    AF多价O血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2O11因子血清做凝集试验。根据试验结果,判定O群。被O3、10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验,判定E1、E4各亚群,每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果,没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

    不被AF多价O血清凝集者,先用9种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O群血清逐一检查,以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下:

     O多价1  A,B,C,D,E,F,群 (并包括6,14群)

     O多价2  13,16,17,18,21

     O多价3  28,30,35,38,39

     O多价4  40,41,42,43

     O多价5  44,45,47,48

     O多价6  50,51,52,53

     O多价7  55,56,57,58

     O多价8  59,60,61,62

     O多价9  63,65,66,67

5.5.4.2  H抗原的鉴定

    属于AFO群的常见菌型,依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。                        

表6  A~F群常见菌型 H抗原表

O群       

第1相          

第2相

A

B

B

C1

C2

D( 不产气的

D产气的

E1

E4

E4

a

 g,f,s

i,b,d 

k,v,r,c

b,d,r

d

 g,m,p,q

 h,v

 g,s,t

i

 

2

5,Z15

2,5

                        

6,w,x

   

不常见的菌型,先用8种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查,以第1相和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下:

     H多价1   a,b,c,d,i

     H多价2   eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51

     H多价3   k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40

     H多价4   1,2;1,5;1,6;1,7;z6

     H多价5   z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38

     H多价6   z39,z41,z42,z44

     H多价7   z52,z53,z54,z55

     H多价8   z56,z57,z60,z61,z62

    每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果,没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。

    检出第1H抗原而未检出第2H抗原的或检出第2H抗原而未检出第1H抗原的,可在琼脂斜面上移种12代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原,要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。

    位相变异试验方法如下:

简易平板法:将0.350.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。

小玻管法:将半固体管(每管约1 mL2 mL)在酒精灯上溶化并冷至50 ,取已知相的H因子血清0.05 mL0.1 mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内,俟凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1:2001:800的量加入。

    小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50 ,挑取因子血清1环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,俟凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,于37 培养后再做凝集试验。    

5.5.4.3  Vi抗原的鉴定

    Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。

5.5.4.4  菌型的判定

根据血清学分型鉴定的结果,按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。

6  结果与报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25 gmL)样品中检出或未检出沙门氏菌。


附录A

(规范性附录)

培养基和试剂

A.1  缓冲蛋白胨水(BPW

A.1.1  成分

蛋白胨

10.0 g

氯化钠

5.0 g

磷酸氢二钠(含12个结晶水)

9.0 g

磷酸二氢钾

1.5 g

蒸馏水

1 000 mL

     pH 7.2±0.2

A.1.2  制法

将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10 min,煮沸溶解,调节pH,高压灭菌121 ,15 min。

A.2  乳糖肉汤(LB)

A.2.1  成分

蛋白胨

5.0 g

乳糖

5.0 g

牛肉膏

3.0 g

蒸馏水

1 000 mL

     pH 6.9±0.2

A.2.2  制法

将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,煮沸溶解,调节pH,高压灭菌121 ,15 min。

A.3  胰酪胨大豆肉汤(TSB)

A.3.1  成分

胰胨

17.0 g

多价胨

3.0 g

氯化钠

5.0 g

磷酸氢二钾

2.5 g

葡萄糖

2.5 g

蒸馏水

1 000 mL

     pH 7.2-7.4

A.3.2  制法

将各成分加入蒸馏水中,加热搅拌溶解,调节pH,高压灭菌121 ,15 min。

A.4  再造脱脂奶粉

A.4.1  成分

脱脂奶粉

100.0 g

蒸馏水

1 000 mL

A.4.2  制法

脱水脱脂奶粉加入蒸馏水中,搅拌溶解,高压灭菌121 ,15 min。

A.5  1%煌绿水溶液(BG)

A.5.1  成分

煌绿

1.0 g

蒸馏水

100 mL

A.5.2  制法

溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。

A.6  通用前增菌肉汤(UPB)

A.6.1  成分

5.0 g

示蛋白胨

5.0 g

磷酸二氢钾

15.0 g

磷酸氢二钠

7.0 g

氯化钠

5.0 g

葡萄糖

0.5 g

硫酸镁

0.25 g

枸橼酸铁铵

0.1 g

丙酮酸钠

0.2 g

蒸馏水

1 000 mL

     pH 6.3±0.2

A.6.2  制法

将各成分加入蒸馏水中,加热搅拌溶解,调节pH,高压灭菌121 ,15 min。

A.7  四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液

A.7.1  基础液

蛋白胨

10.0 g

牛肉膏

5.0 g

氯化钠

3.0 g

碳酸钙

45.0 g

蒸馏水

1 000 mL

pH 7.0±0.2

除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH,高压灭菌121 ,20 min。

A.7.2  硫代硫酸钠溶液

硫代硫酸钠(含5个结晶水)

50.0 g

蒸馏水

加至100 mL

高压灭菌121 ,20 min。

A.7.3  碘溶液

 

20.0 g

碘化钾

25.0 g

蒸馏水

加至100 mL

将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。

A.7.4  0.5%煌绿水溶液

煌绿

0.5 g

蒸馏水

100 mL

溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。

A.7.5  牛胆盐溶液

牛胆盐

10.0 g

蒸馏水

100 mL

加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121 ,20 min。

A.7.6  制法

基础液

900 mL

硫代硫酸钠溶液

100 mL

碘溶液

20.0 mL

煌绿水溶液

2.0 mL

牛胆盐溶液

50.0 mL

临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种成分。

A.8  氯化镁孔雀绿大豆RVS)增菌液

A.8.1  成分

大豆胨

 5.0 g

氯化钠

 8.0 g

磷酸二氢

 1.4 g

磷酸氢二

 0.2 g

氯化镁

 400.0 g

孔雀绿

 0.04 g

蒸馏水

1 000 mL

pH 5.2±0.1

A.8.2  制法

将各成分加入蒸馏水中,加热溶解,调整pH,定量分装于试管中,每管10mL,之后115℃高压湿热灭菌15min,冷却至室温备用。

A.9  亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液

A.9.1  成分

蛋白胨

 5.0 g

乳糖

 4.0 g

磷酸氢二钠

 10.0 g

亚硒酸氢钠

 4.0 g

L-胱氨酸

 0.01 g

蒸馏水

 1 000 mL

pH 7.0±0.2

A.9.2  制法

除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55 以下,以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1 gL L-胱氨酸溶液溶液10 mL(称取0.1 gL-胱氨酸,加1 molL氢氧化钠溶液15 mL,使溶解,再加无菌蒸馏水至100 mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH。

A.10  亚硫酸铋(BS)琼脂

A.10.1  成分

蛋白胨

10.0 g

牛肉膏

5.0 g

葡萄糖

5.0 g

硫酸亚铁

0.3 g

磷酸氢二钠

4.0 g

 绿

0.025 g5.0gL水溶液5.0mL

柠檬酸铋铵

2.0 g

亚硫酸钠

6.0 g

 

18.0 g20 g

蒸馏水

1 000 mL

pH 7.5±0.2

A.10.2  制法

将前三种成分加入300 mL蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20 mL30 mL蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20 mL30 mL蒸馏水中,琼脂加入600 mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至80 左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH,随即倾入琼脂液中,混合均匀,冷至50 55 。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。

:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48 h会降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。

A.11  HE 琼脂Hektoen Enteric Agar

A.11.1  成分

蛋白胨                     

12.0 g

牛肉膏

3.0 g

乳糖

12.0 g

蔗糖

12.0 g

水杨素

2 .0 g

胆盐

20.0 g

氯化钠

5.0 g

琼脂

18.0 g20.0 g

蒸馏水

1 000 mL

0.4%溴麝香草酚蓝溶液

16.0 mL

Andrade指示剂

20.0 mL

甲液

20.0 mL

乙液

20.0 mL

pH 7.5±0.2

A.11.2  制法

将前面七种成分溶解于400 mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600 mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50 55 倾注平皿。

:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性。

       甲液的配制           

硫代硫酸钠

34.0 g

柠檬酸铁铵

4.0 g

蒸馏水

100 mL

       乙液的配制           

去氧胆酸钠

       10.0 g

蒸馏水

       100 mL

        Andrade 指示剂          

酸性复红

    0.5 g

1mol/L氢氧化钠溶液

    16.0 mL

蒸馏水

    100 mL

将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1 mL2 mL。

A.12  木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂

A.12.1  成分

酵母膏

3.0 g

L-赖氨酸

5.0 g

木糖

3.75 g

乳糖

7.5 g

蔗糖

7.5 g

去氧胆酸钠

2.5 g

柠檬酸铁铵

0.8 g

硫代硫酸钠

6.8 g

氯化钠

5.0 g

琼脂

15.0 g

酚红

0.08 g

蒸馏水

1 000 mL

       pH 7.4±0.2

A.12.2  制法

除酚红和琼脂外,将其他成分加入400 mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中,煮沸溶解。

将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至50 55 倾注平皿。

:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备,第二天使用。

A.13  三糖铁(TSI)琼脂

A.13.1  成分

蛋白胨

20.0 g

牛肉膏

5.0 g

 

10.0 g

 

10.0 g

葡萄糖

1.0 g

硫酸亚铁铵(含6个结晶水)

0.2 g

 

0.025 g5.0 gL溶液5.0 mL

氯化钠

5.0 g

硫代硫酸钠

0.2 g

 

12.0 g

蒸馏水

1 000 mL 

pH 7.4±0.2

A.13.2  制法

除酚红和琼脂外,将其他成分加入400 mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中,煮沸溶解。

将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约2 mL4 mL,高压灭菌121  10 min115  15 min,灭菌后置成高层斜面,呈桔红色。

A.14  蛋白胨水、靛基质试剂

A.14.1  蛋白胨水

蛋白胨(或胰蛋白胨) 

20.0 g

氯化钠                      

5.0 g 

蒸馏水

1 000 mL

          pH 7.4±0.2

将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH,分装小试管,121 高压灭菌15 min。

A.14.2  靛基质试剂

A.14.2.1  柯凡克试剂:5 g对二甲氨基甲醛溶解于75 mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25 mL。

A.14.2.2  -波试剂:1 g对二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20 mL。

A.14.3  试验方法

    挑取小量培养物接种,36 ±1 培养1 d2 d,必要时可培养4 d5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5 mL,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

    :蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。

A.15  尿素琼脂(pH 7.2) 

A.15.1  成分

蛋白胨

1.0 g

氯化钠

5.0 g

葡萄糖

1.0 g

磷酸二氢钾

2.0 g

0.4%酚 

3.0 mL

 

20.0 g

蒸馏水

1 000 mL

20%尿素溶液 

100 mL

pH7.2±0.2

A.15.2  制法

除尿素、琼脂和酚红外,将其他成分加入400 mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。另将琼脂加入600 mL蒸馏水中,煮沸溶解。

将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂后分装,121 高压灭菌15 min。冷至50 55 ,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%。分装于无菌试管内,放成斜面备用。

A.9.3  试验方法

    挑取琼脂培养物接种,36 ±1 培养24 h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

A.16  氰化钾 (KCN) 培养基

A.16.1  成分    

蛋白胨

10.0 g

氯化钠

5.0 g

磷酸二氢钾

0.225 g

磷酸氢二钠

5.64 g

蒸馏水

1 000 mL

0.5%氰化钾

20.0  mL

A.16.2  制法

将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后121 高压灭菌15 min。放在冰箱内使其充分冷却。每100 mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0 mL(最后浓度为1:10 000,分装于无菌试管内,每管约4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在冰箱内,至少可保存两个月。同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。

A.16.3  试验方法

    将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36 ±1 培养1 d2 d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),2 d细菌不生长为阴性(抑制)。

    :氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。

A.17  赖氨酸脱羧酶试验培养基

A.17.1  成分    

蛋白胨

5.0 g

酵母浸膏

3.0 g

葡萄糖

1.0 g

蒸馏水

1000 mL 

1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液

1.0 mL

L-赖氨酸或DL-赖氨酸

0.5 g/100 mL1.0 g/100 mL

pH 6.8±0.2

A.17.2  制法

    除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100 mL,分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5%加入,DL-赖氨酸按1%加入。调节pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内,每管0.5 mL,上面滴加一层液体石蜡,115 高压灭菌10 min。

A.12.3  试验方法

    从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36 ±1 培养18 h24 h,观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。

A.18  糖发酵管

A.18.1  成分

牛肉膏

5.0 g

蛋白胨

10.0 g

氯化钠

3.0 g

磷酸氢二钠(含12个结晶水)

2.0 g

0.2%溴麝香草酚蓝溶液

12.0 mL

蒸馏水

1 000 mL

 pH 7.4±0.2

A.18.2  制法

A.18.2.1  葡萄糖发酵管按上述成分配好后,调节pH。按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,121 高压灭菌15 min。

A.18.2.2  其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100 mL,121 高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内,以无菌操作分装小试管。

:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。

A.18.3  试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,36 ±1 培养,一般2 d3 d。迟缓反应需观察14 d30 d。

A.19  ONPG培养基

A.19.1  成分

邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside

60.0 mg

0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5              

10.0 mL 

1%蛋白胨水(pH7.5 

30.0 mL 

A.19.2  制法

    ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于无菌的小试管内,每管0.5 mL,用橡皮塞塞紧。

A.19.3  试验方法

    自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36 ±1 培养1 h3 h24 h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生,则于1 h3 h变黄色,如无此酶则24 h不变色。

A.20  半固体琼脂

A.20.1  成分

牛肉膏

0.3 g

蛋白胨

1.0 g

氯化钠

0.5 g

琼脂

0.35g0.4 g

蒸馏水

100 mL

      pH 7.4±0.2

A.20.2  制法

    按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH。分装小试管。121 高压灭菌15 min。直立凝固备用。

    :供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。

A.21  丙二酸钠培养基

A.21.1  成分

酵母浸膏

1.0 g

硫酸铵                        

2.0 g 

磷酸氢二钾                     

0.6 g 

磷酸二氢钾                     

0.4 g

氯化钠                         

2.0 g 

丙二酸钠                       

3.0 g

0.2%溴麝香草酚蓝溶液

12.0 mL

蒸馏水

1 000 mL

      pH 6.8±0.2 

A.21.2  制法

    除指示剂以外的成分溶解于水,调节pH,再加入指示剂,分装试管,121 高压灭菌15 min。

A.21.3  试验方法

    用新鲜的琼脂培养物接种,36 ±1 培养48 h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。


附录B

(规范性附录)

常见沙门氏菌抗原

B.1  常见沙门氏菌抗原

    常见沙门氏菌抗原见表B.1。

表B.1 常见沙门氏菌抗原表

         

拉丁菌名

  O    

 H抗原

1     

2

A     

甲型副伤寒沙门氏菌

S. Paratyphi A

1,2,12

a

[1,5]

B     

基桑加尼沙门氏菌

S. Kisangani

1,4,[5],12

a

1,2

阿雷查瓦莱塔沙门氏菌

S. Arechavaleta

4,[5],12

a

1,7

马流产沙门氏菌

S. Abortusequi

4,12

-

e,n,x,

乙型副伤寒沙门氏菌

S. Paratyphi B

1,4,[5],12

b

1,2

利密特沙门氏菌

S. Limete

1,4,12,[27]

b

1,5

阿邦尼沙门氏菌

S. Abony

1,4,[5],12,27

b

e,n,x

维也钠沙门氏菌

S. Wien

1,4,12,[27]

b

l,w

伯里沙门氏菌

S. Bury

4,12,[27]

c

z6

斯坦利沙门氏菌

S. Stanley

1,4,[5],12,[27]

d

1,2

圣保罗沙门氏菌

S. Saintpaul

1,4,[5],12

e,h

1,2

里定沙门氏菌

S. Reading

1,4,[5],12

e,h

1,5

彻斯特沙门氏菌

S. Chester

1,4,[5],12

e,h

e,n,x

德尔卑沙门氏菌

S. Derby

1,4,[5],12

f,g

[1,2]

阿贡纳沙门氏菌

S. Agona

1,4,[5],12

f,g,s

[1,2]

埃森沙门氏菌

S. Essen

4,12

g,m

-

加利福尼亚沙门氏菌

S. California

4,12

g,m,t

[z67]

金斯敦沙门氏菌

S. Kingston

1,4,[5],12,[27]

g,s,t

[1,2]

布达佩斯沙门氏菌

S. Budapest

1,4,12,[27]

g,t

-

鼠伤寒沙门氏菌

S. Typhimurium

1,4,[5],12

i

1,2

拉古什沙门氏菌

S. Lagos

1,4,[5],12

i

1,5

布雷登尼沙门氏菌

S. Bredeney

1,4,12,[27]

l,v

1,7

基尔瓦沙门氏菌

S. Kilwa 

4,12

l,w

e,n,x

海德尔堡沙门氏菌

S. Heidelberg

1,4,[15],12

r

1,2

印地安纳沙门氏菌

S. Indiana

1,4,12

z

1,7

斯坦利维尔沙门氏菌

S. Stanleyville

1,4,[5],12.[27]

z4,z23

[1,2]

伊图里沙门氏菌

S. Ituri

1,4,12

z10

1,5

C1     

奥斯陆沙门氏菌

S. Oslo

6,7,14

a

e,n,x

爱丁保沙门氏菌

S. Edinburg

6,7, 14

b

1,5

布隆方丹沙门氏菌

S. Bloemfontein  

6,7

b

[e,n,x]:z42

丙型副伤寒沙门氏菌

S. Paratyphi C

6,7,[Vi]

c

1,5

猪霍乱沙门氏菌

S. Choleraesuis

6,7

c

1,5

猪伤寒沙门氏菌

S. Typhisuis

6,7

c

1,5

罗米他沙门氏菌

S. Lomita

6,7

e,h

1,5

布伦登卢普沙门氏菌

S. Braenderup

6,7, 14

e,h

e,n,z15

里森沙门氏菌

S. Rissen

6,7, 14

f,g

-

蒙得维的亚沙门氏菌

S. Montevideo

6,7, 14

g,m,[p],s

[1,2,7]

里吉尔沙门氏菌

S. Riggil

6,7

g,[t]

-

奥雷宁堡沙门氏菌

S. Oranieburg

6,7, 14

m,t

[2,5,7]

奥里塔蔓林沙门氏菌

S. Oritamerin

6,7

i

1,5

汤卜逊沙门氏菌

S. Thompson

6,7, 14

k

1,5

康科德沙门氏菌

S. Concord

6,7

l,v

1,2

伊鲁木沙门氏菌

S. Irumu

6,7

l,v

1,5

姆卡巴沙门氏菌

S. Mkamba

6,7

l,v

1,6

波恩沙门氏菌

S. Bonn

6,7

l,v

e,n,x

波茨坦沙门氏菌

S. Potsdam

6,7, 14

l,v

e,n,z15

格但斯克沙门氏菌

S. Gdansk

6,7, 14

l,v

z6

维尔肖沙门氏菌

S. Virchow

6,7, 14

r

1,2

婴儿沙门氏菌

S. Infantis

6,7, 14

r

1,5

巴布亚沙门氏菌

S. Papuana

6,7

r

e,n,z15

巴累利沙门氏菌

S. Bareilly

6,7, 14

y

1,5

哈特福德沙门氏菌

S. Hartford

6,7

y

e,n,x

三河岛沙门氏菌

S. Mikawasima

6,7, 14

y

e,n,z15

姆班达卡沙门氏菌

S. Mbandaka

6,7, 14

z10

e,n,z15

田纳西沙门氏菌

S. Tennessee

6,7, 14

z29

[1,2,7]

布伦登卢普沙门氏菌

S. Braenderup

6,7, 14

e,h

e,n,z15

耶路撒冷沙门氏菌

S. Jerusalem

6,7, 14

z10

l,w

C2     

习志野沙门氏菌

S.Narashino

6.8

a

e,n,x

名古屋沙门氏菌

S.Nagoya

6,8

b

1,5

加瓦尼沙门氏菌

S.Gatuni

6,8

b

e,n,x

慕尼黑沙门氏菌

S.Muenchen

6,8

d

1,2

蔓哈顿沙门氏菌

S.Manhattan

6,8

d

1,5

纽波特沙门氏菌

S.Newport

6,8,20

e,h

1,2

科特布斯沙门氏菌

S.Kottbus

6,8

e,h

1,5

茨昂威沙门氏菌

S.Tshiongwe

6,8

e,h

e,n,z15

林登堡沙门氏菌

S.Lindenburg

6,8

i

1,2

塔科拉迪沙门氏菌

S.Takoradi

6,8

i

1,5

波那雷恩沙门氏菌

S.Bonariensis

6,8

i

e,n,x

利齐菲尔德沙门氏菌

S.Litchfield

6,8

l,v

1,2

病牛沙门氏菌

S.Bovismorbificans

6,8, 20

r,[i]

1,5

查理沙门氏菌

S.Chailey

6,8

z4,z23

e,n,z15

C3     

巴尔多沙门氏菌

S. Bardo

8

e,h

1,2

依麦克沙门氏菌

S. Emek

8,20

g,m,s

-

肯塔基沙门氏菌

S. Kentucky

8, 20

i

z6

D     

仙台沙门氏菌

S. Sendai

1,9,12

a

1,5

伤寒沙门氏菌

S. Typhi

9,12,[Vi]

d

-

塔西沙门氏菌

S. Tarshyne

9,12

d

1,6

伊斯特本沙门氏菌

S. Eastbourne

1,9,12

e,h

1,5

以色列沙门氏菌

S. Israel

9,12

e,h

e,n,z15

肠炎沙门氏菌

S. Enteritidis

1,9,12

g,m

[1,7]

布利丹沙门氏菌

S. Blegdam

9,12

g,m,q

-

沙门氏菌 

Salmonella 

1,9,12

g,m,[s],t

[1,5,7]

都柏林沙门氏菌

S. Dublin

1,9,12,[Vi]

g,p

-

芙蓉沙门氏菌

S. Seremban

9,12

i

1,5

巴拿马沙门氏菌

S. Panama

1,9,12

l,v

1,5

戈丁根沙门氏菌

S. Goettingen

9,12

l,v

e,n,z15

爪哇安纳沙门氏菌

S. Javiana

1,9,12

L,z28

1,5

-雏沙门氏菌

S. Gallinarum-Pullorum

1,9,12

-

-

E1     

奥凯福科沙门氏菌

S. Okefoko

3,10

c

z6

瓦伊勒沙门氏菌

S. Vejle

3,{10},{15}

e,h

1,2

明斯特沙门氏菌

S. Muenster

3,{10}{15}{15,34}

e,h

1,5

鸭沙门氏菌

S. Anatum

3, {10}{15}{15,34}

e,h

1,6

纽兰沙门氏菌

S. Newlands

3,{10},{15,34}

e,h

e,n,x

火鸡沙门氏菌

S. Meleagridis

3, {10}{15}{15,34}

e,h

l,w

雷根特沙门氏菌

S. Regent

3,10

f,g,[s]

[1,6]

西翰普顿沙门氏菌

S. Westhampton

3,{10}{15}{15,34}

g,s,t

-

阿姆德尔尼斯沙门氏菌

S. Amounderness

3,10

i

1,5

新罗歇尔沙门氏菌

S. New-Rochelle

3,10

k

l,w

恩昌加沙门氏菌

S. Nchanga

3,{10}{15}

l,v

1,2

新斯托夫沙门氏菌

S. Sinstorf

3,10

l,v

1,5

伦敦沙门氏菌

S. London

3,{10}{15}

l,v

1,6

吉韦沙门氏菌

S. Give

3,{10}{15}{15,34}

l,v

1,7

鲁齐齐沙门氏菌

S. Ruzizi

3,10

l,v

e,n,z15

乌干达沙门氏菌

S. Uganda

3,{10}{15}

l,z13

1,5

乌盖利沙门氏菌

S. Ughelli

3,10

r

1,5

韦太夫雷登沙门氏菌

S. Weltevreden

3,{10}{15}

r

z6

克勒肯威尔沙门氏菌

S. Clerkenwell

3,10

z

l,w

列克星敦沙门氏菌

S. Lexington

3,{10}{15}{15,34}

z10

1,5

E4     

萨奥沙门氏菌

S. Sao

1,3,19

e,h

e,n,z15

卡拉巴尔沙门氏菌

S. Calabar

1,3,19

e,h

l,w

山夫登堡沙门氏菌

S. Senftenberg

1,3,19

g,[s],t

-

斯特拉特福沙门氏菌

S. Stratford

1,3,19

i

1,2

塔克松尼沙门氏菌

S. Taksony

1,3,19

i

z6

索恩保沙门氏菌

S. Schoeneberg

1,3,19

z

e,n,z15

F     

昌丹斯沙门氏菌

S. Chandans

11

d

[e,n,x]

阿柏丁沙门氏菌

S. Aberdeen

11

i

1,2

布里赫姆沙门氏菌

S. Brijbhumi

11

i

1,5

威尼斯沙门氏菌

S. Veneziana

11

i

e,n,x

阿巴特图巴沙门氏菌

S. Abaetetuba

11

k

1,5

鲁比斯劳沙门氏菌

S. Rubislaw

11

r

e,n,x

  

浦那沙门氏菌

S.Poona

1,13,22

z

1,6

里特沙门氏菌

S.Ried

1,13,22

z4,z23

[e,n,z15]

密西西比沙门氏菌

S.Mississippi

1,13,23

b

1,5

古巴沙门氏菌

S.Cubana

1,13,23

z29

-

苏拉特沙门氏菌

S.Surat

[1],6,14,[25]

r,[i]

e,n,z15

松兹瓦尔沙门氏菌

S.Sundsvall

[1],6,14,[25]

z

e,n,x

非丁伏斯沙门氏菌

S.Hvittingfoss

16

b

e,n,x

威斯敦沙门氏菌

S.Weston

16

e,h

z6

上海沙门氏菌

S.Shanghai

16

l,v

1,6

自贡沙门氏菌

S.Zigong

16

l,w

1,5

巴圭达沙门氏菌

S.Baguida

21

z4,z23

-

迪尤波尔沙门氏菌

S.Dieuoppeul

28

i

1,7

卢肯瓦尔德沙门氏菌

S.Luckenwalde

28

z10

e,n,z15

拉马特根沙门氏菌

S.Ramatgan

30

k

1,5

阿德莱沙门氏菌

S.Adelaide

35

f,g

-

旺兹沃思沙门氏菌

S.Wandsworth

39

b

1,2

雷俄格伦德沙门氏菌

S.Riogrande

40

b

1,5

莱瑟沙门氏菌

S.Lethe 

41

g,t

-

达莱姆沙门氏菌

S.Dahlem

48

k

e,n,z15

沙门氏菌IIIb

Salmonella IIIb

61

l,v

1,5,7

注:关于表内符号的说明:

{}={}O因子具有排他性。在血清型中{}内的因子不能与其他{}内的因子同时存在,例如在O:3,10中当菌株产生O:15O:15,34因子时它替代了O:10因子。

[]= O(无下划线)或H因子的存在或不存在与噬菌体转化无关,例如O:4群中的[5]因子。H因子在[]内时表示在野生菌株中罕见,例如极大多数S.Paratyphi A具有一个位相(a),罕有第2相(1,5)菌株。因此,用1,2,12:a:[1,5]表示。

_=下划线时表示该O因子是由噬菌体溶原化产生的。

 

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