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生物标志物在微生物鉴定和检测中的应用



录入时间:2015-12-3 15:47:50 来源:青岛银河澳门官网入口

  生物标志物(Biomarker)是微生物中含有的一些化学物质,其含量或结构具有种属特征或与其分类位置密切相关,能够标志某一类或某种特定微生物的存在。这些具有分类学意义的化学物质的种类和含量可以作为鉴定微生物的指标。传统的微生物分离培养、生化鉴定和血清学鉴定的方法越来越难以适应环境、食品、临床标本中微生物的快速、准确检测的要求。PCR、特异性核酸探针杂交、基因芯片、生物传感器、免疫学技术等都是利用微生物生物学特性的检测鉴定技术。随着分析化学技术日新月异,很多仪器分析手段如高效液相色谱(Highperformanceliquidc hromatography,H PLC) ,气相色谱(Gasc hromatography,GC ) ,气相色谱一质谱联用(Gaschromatographymasssp ectrometry,GC -MS),液相色谱一质谱联用(LC-MS/MS)等,逐渐显示了在微生物检测中的潜力。这些分析化学的手段有别于依赖生物学特性的检测方法,主要通过分析微生物的化学组成鉴定微生物,开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径。

  生物标志物的种类很多,包括不饱和脂肪酸、蛋白质、核酸、类脂、磷脂、多糖和类等,此外还有一些特殊的化学物质仅存在于一些特定的微生物中,如芽抱中含有毗吮二狡酸(Dipicolinic acidy DAP),分枝杆菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属和红球菌属等都含有的分枝菌酸,也是鉴定细菌的重要物质。已有商品化的用于细菌检测的分析化学系统,如美国MIDI公司的细菌脂肪酸GC鉴定系统、细菌分枝菌酸HPLC鉴定系统等。多数方法利用生物标记物在不同细菌中的分布谱不同鉴定细菌,在检测这些生物标记物的过程当中,许多分析化学技术和手段相继被建立,本文将就生物标志物的种类、应用和发展状况做一概述。

  脂类是最常见的生物标志物,在这方面有大量的文献报道和多种分析技术的应用,作为标志物用于细菌鉴定早在60年代就开始了。1987年,有人用快原子轰击质谱(Fast atom bombardment massspectrometry,FA B-MS)检 测细菌提取物中的脂类成分,并成功地鉴定了细菌〔1,2)。脂类易于被提取和浓缩,其结构的变化与病原菌的营养和生理状况相关,在某些情况下还可以指示细菌的传染性,如霍乱弧菌脂类结构的变化可以指示细菌由可培养到非可培养的转换,而非可培养菌的感染性也大大降低(3)。结核分枝杆菌表面蜡样结构中的微蜡样酸和次级醇与抗药性有关。极性脂类的结构也与培养特性有关,G一菌受氧化型生物杀灭剂作用后产生氧化型脂肪酸,氧化型脂肪酸的存在表明了细菌的非可培养性。

  大多数 G +菌中支链C15 :。脂肪酸丰度很高,而在大多数G一菌中C16:。丰度较高(4)。一些细菌如考克斯氏体属,土拉弗朗西丝菌属,军团菌属和结核分枝杆菌属细菌有其特殊的脂类,可经PLFA(Phospholipid fatty acid)分析实现鉴定。另外,在葡萄球菌属,鞘氨醇单胞菌属,假单胞菌属和梭菌属中存在属特异性的脂类,通过分析不同菌种脂类结构的特点还可进一步提高脂类分析的特异性

  Sm ith 等 用ESI-MS( El ectorsprayio nizationm assspectrometry)检测细菌中的甘油磷酸脂。MS/MS分析得到的有意义的信息主要是酞基(R-CO:)的种类及其强度,该报道分析了三种芽抱杆菌属细菌和大肠杆菌的氯仿一甲醇提取物,发现它们的甘油磷酸脂成分有明显的区别,同时作者也提到必需将细菌在标准的条件下培养才能用这种方法鉴定细菌(9lo B orrett等用ESI-MS的检测方法研究大肠杆菌和炭疽杆菌的脂肪酸成分经乙醇或次氯酸盐消毒处理后的变化,表明这种方法可以对已消毒的细菌进行鉴定。

  目前 已 有一种商业化的细菌脂肪酸甲醋(FAME)G C分析系统,称Sherlock系统(美国MIDI公司)。细菌在标准的培养条件下培养和收获,经过有机溶剂的萃取和甲醋化,注人GC系统中分析,一个分析周期约2h(细菌培养时间除外)。脂肪酸定性由Sherlock系统根据细菌脂肪酸谱中色谱峰的tR,检索其内置的脂肪酸库而完成(其数据库的范围限于012,0-C20;。的脂肪酸),经百分归一化处理,给出相对定量数据。本实验室曾利用该系统分析了32个需氧芽胞杆菌的繁殖体和芽胞的脂肪酸成份,并得到一些有意义的分类学结果。

  Bas ile 等 报道了一种可移动式热裂解质谱(Py-orlysism asssp ectrometry, Py -MS)方法。细菌全细胞(107-108)与甲基化试剂混合后经热裂解,由毛细石英管导人EI源,质量分析器为离子阱型。测定了鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西丝菌、布鲁氏菌、炭疽芽胞杆菌的脂肪酸甲醋,与经标准MIDI系统样品处理后的Py-MS质谱图有很好的对应关系。Py-MS采用原位热裂解甲醋化,样品处理只需30 s,分析周期仅为10 min。而且除脂肪酸外,还检测到了芽抱中的特殊成分DPA的甲醋化衍生物。根据四种生物战剂质谱图中峰位和峰强的不同,极易将它们区分开。其缺点是仍免不了细菌的分纯培养过程。

  与甲基化试剂混合后经热裂解,由毛细石英管导人EI源,质量分析器为离子阱型。测定了鼠疫耶尔森氏菌、土拉弗朗西丝菌、布鲁氏菌、炭疽芽胞杆菌的脂肪酸甲醋,与经标准MIDI系统样品处理后的Py-MS质谱图有很好的对应关系。Py-MS采用原位热裂解甲醋化,样品处理只需30 s,分析周期仅为10 min。而且除脂肪酸外,还检测到了芽抱中的特殊成分DPA的甲醋化衍生物。根据四种生物战剂质谱图中峰位和峰强的不同,极易将它们区分开。其缺点是仍免不了细菌的分纯培养过程。

  类几乎存在于所有生物中,主要包括泛和甲基蔡类。每种细菌都有一种主要的类成分,一个微生物群体中酿类的种类和数量的不同反映了群体组成的多样性,酿类谱已经作为指示细菌群体组成多样性的一个指标在环境微生物学中广泛使用〔13)0类在细菌和真核生物中是需氧呼吸链上的电子传递体,其结构中的异戊二烯侧链的长度有重要的分类学意义。真核生物线粒体主要含UQ10,G一菌主要含有UQ4UQ10,兼性厌氧菌如大肠杆菌还含有蔡、甲基禁、去甲基蔡酿,而古细菌缺乏泛(14)ade等报道提取细菌细胞中的中性脂类,用LC-MS检测环境中的泛,最低检测限为9ppb,相当于1.29 x 10 ,个细菌〔'5)o N ishijima等人用Frit-FAB(Frit-fast atom bombardment)HPLCMS联用技术检测了15种标准菌株的泛、甲基酿

及其类似物。该方法利用色谱保留时间、UV检测和MS检测的信息,可以得知类的组成和含量。

脂多糖和脂寡糖

  脂寡糖 (Lipooligosaccharides,LO S)和脂多糖(Li popolysaccharides,LP S)G一菌细胞表面重要的抗原决定簇,特定的分子组成决定着抗原的结构和宿主与病原之间的相互作用。文献报道用ESI-MS分析流感嗜血杆菌、杜克莱氏嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、伤寒沙门氏菌的LOSLPS0一去酸基产物的方法,作者认为在对LOS/LPS结构了解的情况下可以实现这些菌株的鉴定。由于 外 界 环境的刺激会使LOS/LPS有所变化,它不十分适合用来鉴定细菌,但是LOS/LPS是血清型划分的基础,因此分析这些物质的含量能够建立生物学分型和化学分型之间的关系。用MS的手段分析临床分离病原菌的LOS/LPS,还可了解LOS/LPS的结构和致病性之间的关系。

分枝菌酸

  分枝杆菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属和红球菌属的细菌中含有分枝菌酸,不同种属的细菌所含分枝菌酸的组成恒定,且各不相同,计算HPLC色谱图中色谱峰的相对峰高比和相对保留时间对于鉴定这些细菌有重要意义。Butler等用HPLC鉴别了来自这几个属的细菌,并且就高效液相色谱分析分枝菌酸在鉴定细菌中的应用做了全面综述〔021, K ellogg等用MIDI公司的SMIS(Sherlock mycobacteria identificationsystem)系统分析了370株分枝杆菌属的分离株,正确率为75%,经过计算相对峰高比和相对保留时间校正,原来没有正确鉴定的菌株90%以上都实现了正确鉴定〔2')o C hou等报道了用气相色谱检测分枝杆菌属中10个种的29株细菌的脂肪酸、次级醇和分枝菌酸,正确鉴定了全部60个从痰液中得到的分离株,用在Bactec 7H12 B基质上培养6天的培养物作为分析的样品,大大的缩短了此类细菌的鉴定时间。

多糖

  细菌的多糖占其干重的0.1%2%,两以用于种属鉴定和推测细菌的生理状况。附表列举了一些多糖在细菌中特异性的分布, HPLC测定多糖和糖蛋白中分离出的糖已经是比较成熟的方法,全细胞裂解液中多糖成分的测定可以为分类学提供有意义的信息。GC-MS/MS检测环境样品和临床标本中细菌多糖的醇醛酸衍生物具有高灵敏度、高特异性,FoxGC-MS检测复杂基质中细菌糖类成分做了全面综述。通过水解把细菌全细胞中的多糖释放出来,然后加人衍生化试剂反应生成糖的醇醛酸形式,再进行GC-MS分析。目前这一样品处理方法已经可以实现自动化,为细菌多糖成分全自动分析及其仪器化奠定了基础。蜡样 芽 胞 杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌的表型和基因型非常接近,正确鉴定、区分三者一直是细菌分类鉴定中的一个难题。在多糖成分的GCMs图中,炭疽芽胞多糖成分也有显著的高于其余两者,而枯草芽胞杆菌的甘露糖氨显著低于前三者。它们的芽胞多糖成分也有明显的区别,炭疽芽胞杆菌只含有鼠李糖和3-0一甲基鼠李糖,其它三者还含有海藻糖和2一甲基鼠李糖。

胞壁酸

  胞壁酸是所有真细菌(除支原体和衣原体外)细胞壁中特有的氨基糖,在自然界其它生物包括动物细胞、体液、真菌中都不存在,占细菌干重的4%,可作为从复杂的生物、环境样本中检测痕量细菌的一个标记分子。胞壁酸(Muramic acid)的检测往往需要衍生化过程,如胞壁酸的丹磺酞衍生物,三氟乙酞化衍生物和三甲基硅烷化衍生物等,检测手段主要是LC-MS,GC-MS(25)。通过酸水解把胞壁酸释放出来,中和多余的酸,再加人一定量的内标,经MS/MS测定可以给出定性定量结果。类似的其它氨基糖也可以用作化学分类的标志物,如军团杆菌属中的异鼠李糖胺(Quinovosamine)和岩藻聚糖胺(Fu cosamine) ,半乳糖胺的含量不同可区分炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌〔26)o K ozar(27〕等分析了灰尘和空气样品中的胞壁酸,样品经过分离纯化和卤化衍生化进行GC-MS/MS分析,检测样品为物体表面灰尘和室外空气样品,胞壁酸含量分别为1.66 n ml1.4/5.9 nml, Black等用硫酸裂解细菌全细胞,然后用有机碱性溶剂中和过量的酸,注人ESIMS/MS直接分析未经衍生化的胞壁酸,作者采用了多反应监测扫描(Multiple reaction monitoring)可以提高选择性和灵敏度,避免了繁琐的衍生化步骤。

蛋白质

  细菌基因组约编码几千个蛋白质,其种类多、分子量覆盖范围广使得以其中某一种蛋白质特异地鉴定某种细菌几乎是不可能的。但是,正是由于蛋白质的多样性和丰富性,利用菌体内的多个蛋白质质量信息的分析方法很有希望成为鉴定细菌更为有效的手段。目前,以蛋白质为靶分子鉴定细菌的报道很多,有以下方面的研究结果。

7.1 以一组细菌的蛋白质图谱的差异为鉴定指标研究 

  几种近源菌或相关菌蛋白质图谱的差异,把这些差异做为鉴定细菌的指标。Krishnamurthy等报道用LC/ESI-MS为检测手段,分析了9种不同种属的细菌。用含0-20%乙睛的0.1 % TFA悬浮冷冻干燥的细菌,浓度为0.6V g /闪,涡流2m in,离心2min,上清液用滤膜过滤,注人HPLC系统。LC-MS分析时间仅为12 min。蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌在此分析条件下各有其特异的蛋白质,非常容易区分,此外它们还有种内共有的标志物。Hendrickera等以热裂解质谱为检测手段,以鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、土拉弗朗西丝菌、布鲁氏菌的菌悬液为标本,检测了脂肪酸、DPA,DNA、蛋白质降解物的氢氧化四乙基胺甲醋化产物,用统计学方法判读结果('0),, DNA在此条件下降解为单个碱基,蛋白质降解为非常短的肤,质谱检测范围在400 D以下,对54份样品各分析4次,整个分析的正确率为98%。但是,用这种方法鉴定细菌的能力仅局限于研究范围之内的细菌,对于其它未知菌的鉴定还是无能为力。Conway等将pap操纵子克隆入pACYCl8斗,然后把重组质粒pRHU-845导人大肠杆菌。已知pap编码蛋白的分子量为16554 D,MALDI-TOF MS分析,重组大肠杆菌(pRHU-845/pap)比未重组大肠杆菌(pACYC184/pap)多一个m/z'16 556.9 D的质谱峰,表明单一的蛋白的差别可以通过质谱分析显现出来,为检测可能的基因重组微生物提供了重要手段。

7.2 根据某科、属的细菌蛋白质图谱做分类学研究

  Con wa y等 分析了25种致病性大肠杆菌和9种肠杆菌科其它属的细菌,检测到40100个质谱峰,分子量最大达到25 kD(3'l。细菌过夜培养、收集后冷冻干燥,制成1 mm1的菌液,与。一轻基肉桂酸的饱和溶液相混合,用MALDI-TOF MS(Matrix assis-ted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)检测,检测限为1.8 x 1 0,个菌。用溶菌酶处理细菌,质谱图上并没有增加色谱峰;在溶菌酶处理细菌后,用蛋白酶K消化,所有的蛋白质质谱峰都消失了,证明本方法可以检测细胞内的蛋白质。

大肠杆菌不同株的MALDI-TOF质谱图之间既存在特异的峰又有很大的相似性,易与其它肠杆菌科的细菌(包括沙门氏菌和志贺氏菌)相区分。

7.3 用未知菌的质谱图检索标准菌株的蛋白质指纹图谱库

  首先 建 立 标准菌株的蛋白质指纹图谱库,未知菌株经标准程序分析,通过一定的数理统计方法进行数据库检索。该方法对数据库的容量,包括数据库中不同菌种、菌株的覆盖范围有很大的依赖性,要求分析方法在一定的细菌培养和质谱分析条件下重现性好。英国Micromass公司的MALDI-TOF线性飞行时间质谱仪配有60多个属,300多种细菌的指纹图谱数据库,供用户检索使用。该软件还允许用户自定义数据库,用户可以自行标准化从细菌培养到质谱分析的过程,建立由目标菌株构成的数据库,可以大大提高鉴定的准确性和拓展应用范围。

7.4 用未知菌的质谱图检索蛋白质分子量数据库

  微生物基因组学和蛋白质组学的研究提供了日益丰富的蛋白质数据,为MS鉴定细菌开辟了新途径。其基本思路是用未知菌的质谱峰与蛋白质数据库中(Swiss-Prot)已知菌的蛋白质分子量相匹配,匹配率最高的为未知菌的鉴定结果。利用软件调取细菌某一范围内全部蛋白质的分子量作为参照,将得到的质谱峰与其相对照,通过数理统计软件分析给出鉴定结果。

  Dai等用HPLC分离大肠杆菌裂解液中的各个成分,把收集到的流份做MALDITOFMS分析。发现与细菌裂解液直接用MALDI-TOF的质谱图相比较,在219 kD范围内多检出300多个蛋白质,尤其是高分子量蛋白质增加了很多,说明细菌裂解液中的某些物质对MALDITOFMS分析可能有离子抑制效应。作者还对比了不同文献中报道的大肠杆菌的质谱峰。由于各文献中样品处理方法和仪器的参数条件各有不同,得到的质谱峰也各不相同,但是几乎所有的分子量都可以在HPLC收集的流份中找到相应的蛋白,而且在实验上论证了上述途径的可行性。随着细菌基因组全序列信息的不断积累,可以利用的蛋白质信息将越来越多。这种方法在病毒鉴定中同样适用,如Yao等用MALDI-TOFMS分析了空气样品中委内瑞拉马脑炎病毒的胰蛋白酶降解物37。利用六个已测序的病毒基因组数据,计算其理论胰蛋白酶降解的肤图谱,构成数据库。经数据库检索,准确的鉴定了该病毒。

  高分辨质 谱和多级质谱检测具有高选择性和高特异性,如MALDI中的源后延迟技术Post sourcedecay PSD )三重四级杆和离子阱型质量分析器等。这些手段可以从大量的环境物质和背景中检测到特定微生物的生物标志物,还可获得该分子的结构信息,但是这种鉴定手段依赖于对致病菌的生物标志物结构的清晰认识。

核酸

  在 MA LD I-TOFESI-MS方式下,寡核昔酸片段容易带有一个或多个负电荷,以负离子形式被检测。质粒经限制性内切酶消化,得到大小不等的片段,用MS检测片段的分子量可以鉴定某一质粒。Bai等报道将细菌的B6 BLEU5质粒用AlulHae1II酶切,质粒大小为4 658坤,得到27个大小22267by的片段,这些片段以ss-DNA的形式离子化,与预期的片段分子量相符合,但是小于20 nt和大于70nt的片段没有检出。

  最近,Wintzingerode等报道了一种用MALDI-TOF分析16 S rRNA碱基特异性片段实现细菌快速鉴定的方法。在PCR反应中,用d-UTP代替d-TTP,以350帅长度的16 S rDNA单链为模板扩增,该片段包括了高度变异区V1V2o PCR产物经d-UTP糖基化水解酶水解后得到DNA片段,用MALDI-TOF MS分析这些片段的质谱图,与已公布的16S rRNA序列的计算值相比较,可以区分在此片段中仅相差单个碱基的菌株该方法不需细菌培养过程,靶基因也不仅局限于16SrRNA,同样适用于其它基因分型标记分子。这一方法对于非可培养的和难培养细菌具有重要价值。VN RT (V ariablen umberta ndem repeat)技术在个体识别、基因定位及基因诊断方面有较高的应用价值,在细菌鉴定中可以用于细菌的来源追踪。用VNTR技术分析来自佛罗里达州、纽约和华盛顿特区的邮件中的炭疽芽胞杆菌分离株,证实它们是同一来源,这株菌来源于1981年从德克萨斯州死牛中分离出一株菌,该株菌被命名为Ames。

其它

  除了上述几种类型的生物标志物外,其它种类的生物标志物相对较少一些。这是因为脂类、多糖、蛋白质、核酸在细菌内含量较高,种类繁多。还有一些小分子的物质也被用来作为鉴定特定微生物的生物标志物。

  DPA( 毗 吮-2,6一二梭酸)是所有细菌芽胞中特有的一种成分,是区分细菌芽胞和繁殖体的标志物。Goodacre等用巧-MS和傅立叶变换一红外光谱(FTIR)检测DPA,m /z1 05DPA的特征碎片峰;1441439 cm -’代表了比吮环的振动,该方法对26株实验菌株都能正确判定以芽胞还是繁殖体的形式存在(41)o B evaerly等报道用Py-MS检测DPA,分析时间(包括样品制备)10 min,灵敏度为2.2 X 107CFU。

  用经典的生化反应难以检测和鉴定厌氧菌,有人建议通过检测细菌的代谢终产物鉴定细菌,但是从细菌的代谢终产物中找到稳定的标志物比较困难。Arellano等报道,用毛细管电泳一紫外(Capillaryelectrophoresis-ultrav iolet,CE -UV)检测分析厌氧菌的短链脂肪酸,如唬拍酸、丙酮酸、乳酸、丙酸等,共分析了17个种和亚种的11种短链脂肪酸成分,G`菌和G一菌的色谱图有很大的区别,但是,仅依赖短链脂肪酸成分并不能准确地将目标菌鉴定到种的水平。

  二醇 、 街 醇、甘油在评价微生物种群的结构和生理状况方面很有意义。细胞死亡后,在内源性或外源性的磷脂酶的作用下迅速生成甘油二醋〔’〕。这些分子需要经过衍生化,以适合用ESI-MS检测。

10 展望

  随着分析技术的进步和分析微生物学的不断发展,利用生物标志物鉴定微生物的方法将会对临床诊断、环境监测、食品检测产生重大的影响。在某些情况下,分析目标微生物中生物标志物的组成不仅可以确定该微生物的属、种,还可以确定其具体来源于哪个保藏种,在生物恐怖和生物战发生时快速鉴定细菌来源对于事件性质的判断具有重要意义。当然,这需要更为精确的分析方法和相应的数据库支持。

  尽管以上列举了多种类型的生物标志物,仍然很难找到一种在某种、某类微生物中独有的化合物。

  目前,几乎所有通过分析生物标志物而检测和鉴定细菌的方法都是获得某类标志物的分布和含量谱,根据不同的微生物中该标志物的分布不同鉴定目标微生物。建立各种生物标志物在微生物中分布情况的数据库及相应的标准分析程序,仍然是建立微生物检测系统的主要方向。为了提高鉴定的准确性,还可以集合几种方法同时检测几种生物标志物,综合判断鉴定结果。

  另外 , 一些生物标志物的分析方法比较繁琐,涉及到分离、提取、衍生化等步骤,耗时数小时,随着分析技术的进步和各种标志物数据库的完善,这些方法将会向更加简便、迅速、准确和自动化的方向发展。

 

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