范围
本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验和计数方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的快速检验和计数。
规范性引用文件
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GB 4 78 9.3 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
GB 4 78 9.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
ISO 4 83 2:1991(E) 微生物学— 大肠菌群菌落计数法通则
术语和定义
下 列 术 语和定义适用于本标准
3.1
大肠菌群coliform bacteria
大肠菌群是革兰氏阴性、无芽抱、氧化酶阴性的杆状细菌，为需氧和兼性厌氧，可在有胆盐(或具有其他抑制生长的表面活性剂)存在的情况下生长，通常可在36℃士2℃发酵乳糖并产酸和醛。具有件半乳糖昔酶。在本标准设定的条件下，大肠菌群为能分解R-半乳糖昔、使培养基发出荧光或生成紫色(或红色)菌落的一群革兰氏阴性无芽抱杆菌。
4 原理
4.1 最可能数(MPN)法
大 肠 菌 群可产生各半乳糖昔酶，分解液体培养基中的酶底物—4一甲基伞形酮一各D一半乳糖普(以下简称MUGaD，使4一甲基伞形酮游离，因而，在波长366 nm的紫外光灯照射下呈现蓝色荧光。
4.2 平板法
大肠菌群可产生件半乳糖昔酶，分解培养基中的酶底物— 茜素一份D-半乳糖昔(以下简称Alizgal)，使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、钱离子结合形成紫色(或红色)的鳌合物，使菌落呈现相应的颜色。
试剂和培养基
5.1 磷酸盐缓冲液
按 GB 4 789.28-1994中3.22规定进行制备。
5.2 生理盐水
5.2.1 成分
氯化钠 8.5g
蒸 馏 水 10 00m L
5.2.2 制法
将氯化钠溶于蒸馏水，121'C蒸汽灭菌15m in,
5.3 MUGal肉汤
5.3.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g
氯化钠 5.0 g
无水磷酸氢二钾2.75 g
无水磷酸二氢钾2.75 g
月桂基硫酸钠0.1g
MU G .I (纯度不低于99%) 0. 08 g
蒸馏水 1000m L
5.3.2 制法
将各成分加热溶于蒸馏水中，以15% 20肠氢氧化钠溶液调整pH值，分装于20m mX 1 50m m试管，每管9 mL,116"C蒸汽灭菌10 min，最终pH值7.0-7.2。待培养基冷却后，以无菌手续于每管培养液内加人0.1 m L经无菌水稀释的500p g/mL头抱磺徒液或于10 00m L灭菌培养液内加1m L经无菌水稀释的5 mg/mL头抱磺吮液并以无菌操作分装试管。
注 :双 料 MUGal肉汤除燕馏水外，其他成分加倍。
5.4 Aliz-gal琼脂
5.4.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g
氯化钠 5.0 g
无水磷酸氢二钾2.75 g
无水磷酸二氢钾2.75 g
月桂基硫酸钠0.1g
Aliz-gal (纯度不低于97写) 0.05 g
异丙基硫代半乳糖昔0.03g
硫酸铝钾 0.5 g
柠檬酸铁钱0.5 g
琼脂 15.0 g
蒸馏水 1000m L
5.4.2 制法
将各成分放入蒸馏水中，加热使溶化，以15%~ 2 0%NaOH调整pH值，分装烧瓶,1160C燕汽灭菌10m in，最终pH值7.0-7.2
6 设备和器材
培养箱:37℃士10℃
冷藏箱:0℃士4℃
天平:感量0.01 g
均质器或乳钵。
平皿:直径90 mm,
试管:20 mm ×150 mm.
吸管:1.0 ml一和10.0 ml。
广口瓶或三角瓶:容量500 ml
玻璃珠:直径约5 mm
试管架
紫外灯(波长366 nm)
其 他
7检验程序
8 样品的制备
8.1 以无菌手续取25 mL(或25 g)样品，加于含225 mL无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的广口瓶
(或三角瓶)内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，充分振摇或用均质器以8000r/m-10000 r/m均质1 min成1：10稀释液。
8.2 用1m L无菌吸管吸取1，10样品稀释液1.0 m L，注人含9.0 m L无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的试管内，振摇均匀，即成1，10。样品稀释液。
8.3 另取1. 0 mL无菌吸管，按上法制备10倍递增样品稀释液。每递增一次，换一支1. 0 mL无菌吸管。
8.4 根据食品卫生标准要求或对样品污染程度的估计，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种三管培养基(MPN 法)或两个平皿(平板法)。
9 大肠菌群的MPN计数
9.1 将待检样品和样品稀释液接种MUGal肉汤管，每管1. 0 mL(接种量在1. 0 mL以上者，接种双料MUGal肉汤管)。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种3管培养基。同时另取2支MUGal肉汤管(或双料MUGal肉汤管)加人与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)作空白对照。
9.2 将接种后的培养管置于3TC士1'C培养箱培养18 h-24 h
9.3 将培养管置于暗处，用波长366 nm的紫外光灯照射，如显蓝色荧光，为大肠菌群阳性管;如未显蓝色荧光，则为大肠菌群阴性管。
9.4 结果报告:根据大肠菌群阳性管数，查MPN表(见附录A)，报告每100 m工(g)食品中大肠菌群MPN值。
10 大肠菌群的菌落计数
10.1 用灭菌吸管吸取待检样液1. 0 mL，加人无菌平皿内。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种两个平皿。
10.2 于每个加样平皿内倾注巧mL45 C~ 50℃的Aiiz-gal琼脂，迅速轻轻转动平皿，使混合均匀。待琼脂凝固后，再倾注3 mL-5 mL Aliz-gal琼脂覆盖表面。同时将Aliz-gal琼脂倾人加有1 mL上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的无菌平皿内作空白对照。
10.3 待琼脂凝固后，翻转平板，于37℃士1'C培养箱培养18 h-24 h。取出平板，计数紫色(或红色)菌落。
10.4 结果报告
10-4.1 当平板上的紫色(或红色)菌落数不高于150个，且其中至少有一个平板紫色(或红色)菌落不少于15个时，按式(1)计算大肠菌群数：N=∑C/(n1+n2)d
式 中 :
N — 样品的大肠菌群数，个/mL或g;
∑C — 所有计数平板上，紫色(或红色)菌落数之总和;
n1 — 供计数的最低稀释倍数的平板数;
n2 — 供计数的高一稀释倍数的平板数;
d— 供计数的样品最低稀释度(如10-1,10-2,10-3等)
10.4.2 如接种所有(3个)稀释样品的平板上，紫色(或红色)菌落数均少于15个时，仍按式(1)计算，但应在所得结果旁加“‘”号，表示为估计值。
10.4.3 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，紫色(或红色)菌落数均少于15个时，报告结果为:每毫升(克)样品少于15个大肠菌群。
10.4.4 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，均未发现紫色(或红色)菌落数时，报告结果为:每毫升(克)样品少于1个大肠菌群。
10.4.5 如平板上的紫色(或红色)菌落数高于15个时，按式(1)计算，在结果旁加“，”号表示估计值或视情况重新选择较高的稀释倍数进行测定。
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