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食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验



录入时间:2015-9-2 16:08:50 来源:青岛银河澳门官网入口

范围

本标准规定了食品中阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的检验方法。

本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。

设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

2.1 恒温培养箱:25 ℃±℃,36 ℃±℃,44 ℃±0.5 ℃。

2.2 冰箱:℃~℃。

2.3 恒温水浴箱:44 ℃±0.5 ℃。

2.4 天平:感量0.1 g。

2.5 均质器。

2.6 振荡器。

2.7 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。

2.8 无菌锥形瓶:容量100 mL、200 mL、2000 mL。

2.9 无菌培养皿:直径90 mm。

2.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

2.11 全自动微生物生化鉴定系统。

培养基和试剂

3.1 缓冲蛋白胨水(buffer peptone water,BPW):见附录A.1。

3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin

medium,mLST-Vm):见附录A.2。

3.3 阪崎肠杆菌显色培养基。

3.4 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticase soy agar,TSA):见附录A.3。

3.5 生化鉴定试剂盒。

3.6 氧化酶试剂:见附录A.4。

3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基:见附录A.5。

3.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基:见附录A.6。

3.9 L-精氨酸双水解酶培养基:见附录A.7。

3.10 糖类发酵培养基:见附录A.8。

3.11 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见附录A.9。

第一法阪崎肠杆菌的检验

4 检验程序

阪崎肠杆菌检验程序见图1。

 

 

 

5 操作步骤

5.1 前增菌和增菌

取检样100 gmL)加入已预热至44 ℃装有900 mL 缓冲蛋白胨水的锥形瓶中,用手缓缓地摇动至充分溶解,36 ±1 ℃培养18 h±2 h。移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤,44 ±0.5 ℃培养24 h±2h。

5.2 分离

5.2.1 轻轻混匀mLST-Vm 肉汤培养物,各取增菌培养物环,分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板,36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。

5.2.2 挑取1 个~5 个可疑菌落,划线接种于TSA 平板。25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。

5.3 鉴定

自TSA 平板上直接挑取黄色可疑菌落,进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。

第二法 阪崎肠杆菌的计数

7 操作步骤

7.1 样品的稀释

7.1.1 固体和半固体样品:无菌称取样品100 g、10 g、1 g 各三份,加入已预热至44 ℃分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中,轻轻振摇使充分溶解,制成1:10 样品匀液,置36 ℃±1 ℃培养18 h±2 h。分别移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤,44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2 h。

7.1.2 液体样品:以无菌吸管分别取样品100 mL、10 mL、1 mL 各三份,加入已预热至44 ℃分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW 中,轻轻振摇使充分混匀,制成1:10 样品匀液,置36 ℃±1 ℃培养18h±2h。分别移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤,44 ℃±0.5 ℃培养24 h±2 h。

7.2 分离、鉴定

同5.2,5.3。

8 结果与报告

综合菌落形态、生化特征,根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数,查MPN 检索表,报告每100 gmL)样品中阪崎肠杆菌的MPN 值(见附录B中表B.1

附录A

(规范性附录)

培养基和试剂

A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)

A.1.1 成分

蛋白胨 10.0g

氯化钠 5.0 g

磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 9.0 g

磷酸二氢钾 1.5 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.2

A.1.2 制法

加热搅拌至溶解,调节pH,121 ℃高压灭菌15 min。

A.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)

A.2.1 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨(mLST)肉汤

A.2.1.1 成分

氯化钠 34.0 g

胰蛋白胨 20.0 g

乳糖 5.0 g

磷酸二氢钾 2.75 g

磷酸氢二钾 2.75 g

十二烷基硫酸钠 0.1 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.2.1.2 制法

加热搅拌至溶解,调节 pH。分装每管10 mL,121 ℃高压灭菌15 min。

A.2.2 万古霉素溶液

A.2.2.1 成分

万古霉素 10.0 mg

蒸馏水 10.0 mL

A.2.2.2 制法

10.0 mg 万古霉素溶解于10.0 mL 蒸馏水,过滤除菌。万古霉素溶液可以在℃~℃保存15 天。

A.2.3 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm

每 10 mL mLST 加入万古霉素溶液0.1 mL,混合液中万古霉素的终浓度为10 μg/ mL。

注:mLST-Vm 必须在24 h 之内使用。

A.3 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)

A.3.1 成分

胰蛋白胨 15.0 g

植物蛋白胨 5.0 g

氯化钠 5.0 g

琼脂 15.0 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.3±0.2

A.3.2 制法

加热搅拌至溶解,煮沸 1 min,调节pH,121 ℃高压15 min。

A.4 氧化酶试剂

A.4.1 成分

N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0 g

蒸馏水 100 mL

A.4.2 制法

少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在 7 d 之内使用。

A.4.3 试验方法

用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10 s 之内未变为紫红色、紫色或深蓝色,则为氧化酶试验阴性,否则即为氧化酶实验阳性。

注:实验中切勿使用镍/铬材料。

A.5 L-赖氨酸脱羧酶培养基

A.5.1 成分

L-赖氨酸盐酸盐(L-lysine monohydrochloride) 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.5.2 制法

将各成分加热溶解,必要时调节 pH。每管分装5 mL,121 ℃高压15 min。

A.5.3 实验方法

挑取培养物接种于 L-赖氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。

A.6 L-鸟氨酸脱羧酶培养基

A.6.1 成分

L-鸟氨酸盐酸盐(L-ornithine monohydrochloride) 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.6.2 制法

将各成分加热溶解,必要时调节 pH。每管分装5 mL。121 ℃高压15 min。

A.6.3 实验方法

挑取培养物接种于 L-鸟氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。

A.7 L-精氨酸双水解酶培养基

A.7.1 成分

L-精氨酸盐酸盐(L-arginine monohydrochloride) 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.7.2 制法

将各成分加热溶解,必要时调节 pH。每管分装5 mL。121 ℃高压15 min。

A.7.3 实验方法

挑取培养物接种于 L-精氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。

A.8 糖类发酵培养基

A.8.1 基础培养基

A.8.1.1 成分

酪蛋白(酶消化) 10.0 g

氯化钠 5.0 g

酚红 0.02 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.8.1.2 制法

将各成分加热溶解,必要时调节 pH。每管分装5 mL。121 ℃高压15 min。

A.8.2 糖类溶液(D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙)

A.8.2.1 成分

糖 8.0 g

蒸馏水 100 mL

A.8.2.2 制法

分别称取 D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8 g,溶于100 mL 蒸馏水中,过滤除菌,制成80 mg/mL 的糖类溶液。

A.8.3 完全培养基

A.8.3.1 成分

基础培养基 875 mL

糖类溶液 125 mL

A.8.3.2 制法

无菌操作,将每种糖类溶液加入基础培养基,混匀;分装到无菌试管中,每管 10 mL。

A.8.4 实验方法

挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基,刚好在液体培养基的液面下。30 ±1 ℃培养24 h±2 h,观察结果。糖类发酵试验阳性者,培养基呈黄色,阴性者为红色。

A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基

A.9.1 成分

柠檬酸钠 2.0 g

氯化钠 5.0 g

磷酸氢二钾 1.0 g

磷酸二氢铵 1.0 g

硫酸镁 0.2 g

溴百里香酚蓝 0.08 g

琼脂 8.0 g~18.0 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2

A.9.2 制法

将各成分加热溶解,必要时调节 pH。每管分装10 mL,121 ℃高压15 min,制成斜面。

A.9.3 实验方法

挑取培养物接种于整个培养基斜面,36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察结果。阳性者培养基变为蓝色。

附录B

(规范性附录)

阪崎肠杆菌最可能数(MPN)检索表

B.1 阪崎肠杆菌最可能数(MPN)检索表

每100 g(mL)检样中阪崎肠杆菌最可能数(MPN)的检索见表B.1。

 

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