1 范围

本标准规定了食品中双歧杆菌（Bifidobacterium ）的鉴定方法。

本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

a） 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；

b） 气相色谱仪配FID 检测器；

c） 冰箱：2 ℃～5 ℃；

d） 天平： 感量0.1 g；

e） 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm；

f） 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器（200 μL~1000 μL）及配套吸头；

g） 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。

3 培养基和试剂

3.1 双歧杆菌培养基：见附录A 中的A.1。

3.2 PYG 液体培养基：见附录A 中的A.2。

3.3 甲醇：分析纯。

3.4 三氯甲烷：分析纯。

3.5 硫酸：分析纯（体积比）。

3.6 冰乙酸：分析纯（体积比）。

3.7 乳酸：分析纯。

3.8 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1 mol/L。

3.9 乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L。

3.10 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1 mol/L。

3.11 乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L。

4 鉴定程序

双歧杆菌鉴定程序见图1。

5 操作步骤

5.1 样品制备

5.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

5.1.2 以无菌操作称取25 g（mL）样品，置于装有225 mL 生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1:10 的样品匀

液。

5.2 稀释及涂布培养步骤

5.2.1 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL 生理盐水的

无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制

成1:100 的样品匀液。

5.2.2 另取1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按5.2.1 操作顺序，做10 倍递增样品匀液，每递增稀释一

次，即换用1 次1 mL 灭菌吸管或吸头。

5.2.3 根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL 稀释液，用L 棒

在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布, 每个稀释度作两个平皿。置36 ℃±1 ℃ 温箱内培养48 h±2 h，培养后

选取单个菌落进行纯培养。

5.3 纯培养

挑取3 个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36 ℃±1 ℃ 培养48 h。

5.4 镜检及生化鉴定

5.4.1 涂片镜检

双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或

球形，可形成各种分支或分叉形态。

5.4.2 生化鉴定

过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌

菌种主要生化反应见附录B。

5.5 有机酸代谢产物测定

气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物, 见附录C。

6 报告

根据镜检及生化鉴定的结果（5.4）、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1（5.5），

报告双歧杆菌属的种名。

附录 A

培养基

A.1 双歧杆菌琼脂培养基

A.1.1 成分

蛋白胨 15.0 g

酵母浸膏 2.0 g

葡萄糖 20.0 g

可溶性淀粉 0.5 g

氯化钠 5.0 g

西红柿浸出液 400.0 mL

吐温80 1.0 mL

肝粉 0.3 g

琼脂粉 15.0 g～20.0 g

加蒸馏水至 1 000.0 mL

A.1.2 制法

A.1.2.1 半胱氨酸盐溶液

称取半胱氨酸0.5 g，加入1.0 mL 盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。

A.1.2.2 西红柿浸出液

将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在100 ℃水浴中加热，搅拌90 min，然后用纱布过滤，校正pH7.0，将浸出液分装后，121 ℃高压灭菌15 min～20 min。

A.1.2.3 培养基

将A.1.1 所有成分加入蒸馏水中，加热溶解, 然后加入半胱氨酸盐溶液，校正pH 6.8±0.2。分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，冷至50 ℃时使用。

A.2 PYG 液体培养基

A.2.1 成分

蛋白胨 10.0 g

葡萄糖 2.5 g

酵母粉 5.0 g

半胱氨酸-HCl 0.25 g

盐溶液 20.0 mL

维生素K1 溶液 0.5 mL

氯化血红素溶液5mg/mL 2.5 mL

加蒸馏水至 500.0 mL

A.2.2 制法

A.2.2.1 盐溶液

称取无水氯化钙0.2 g，硫酸镁0.2 g，磷酸氢二钾1.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，碳酸氢钠10.0 g，氯化钠2.0 g，加蒸馏水至1000 mL。

A.2.2.2 氯化血红素溶液（5mg/mL）

称取氯化血红素0.5 g 溶于1 mol/L 氢氧化钠1.0 mL 中，加蒸馏水至1000 mL，121 ℃高压灭菌15min～20 min。

A.2.2.3 维生素K1溶液

称取维生素K11.0 g，加无水乙醇99 mL，过滤除菌，冷藏保存。

A.2.2.4 培养基

除氯化血红素溶液和维生素K1 溶液外，A.2.1 其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红溶液。分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和维生素K1 溶液，冷至50 ℃使用。

附录 B

双歧杆菌菌种主要生化反应

双歧杆菌菌种主要生化反应见表B.1。

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