1 范围

  本标准规定了出入境口岸军团菌检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及阳性结果判定、处置。

  本标准适用于出入境口岸军团菌的检验。

2 规范性引用文件

  下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

  GB19489 实验室 生物安全通用要求

  WS195 军团病诊断标准及处理原则

3 术语和定义

  下列术语和定义适用于本标准。

3.1

  军团病

  军团菌属（主要是军团菌）引起的细菌性呼吸道传染病，临床表现有两种类型，非肺炎型和肺炎型。

3.2

  军团菌

  引起军团病的病原菌，系兼性细胞内寄生的革兰氏阴性杆菌，军团菌是人军团菌是人军团病的主要致病菌。

4 实验室生物安全防护

  实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备及个体防护应符合GB19489中二级生物安全防护实验室的要求。

5 对象

5.1 疑似感染军团菌的出入境人员。

5.2 环境污染标本。

6 准备

6.1 检验试剂

6.1.1 细菌培养鉴定及聚合酶链反应（PCR）试剂的制备参见附录A，或购买符合要求的商品化检测试剂盒。

6.1.2 直接荧光抗体染色（DFA）、血清学检验及尿抗原检测见WS195或购买符合要求的商品化试剂。

6.2 仪器设备

  仪器设备参见附录A。

7 标本的采集和处理

7.1 疑似感染者标本的采集

7.1.1 发病期患者的痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织可进行病原学检测，常规采样后立即送检，采样过程中应使用无菌蒸馏水。

7.1.2 无菌方法采集发病期患者胸水，用有盖无菌试管保存，立即送检。

7.1.3 用于培养的尿液标本采样前应清洗并消毒患者尿道口，留取中段尿10ml~20ml，于无菌容器中，立即送检。用于尿抗原检测的标本可常规留取中段尿。

7.1.4 用不抗凝的真空管采集并保存患者急性期（发病3d内）、第3周、第6周血清用于血清学检测。

7.2 疑似感染者标本的处理

7.2.1 肺组织用蒸馏水在无菌条件下制成悬液，痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液、肺组织悬液经酸处理或热处理后进行培养（见7.5）。

7.2.2 无菌方法采集的胸水、消毒尿道口留取的中段尿，血液等正常情况下无菌的标本无需处理直接用于培养。

7.2.3 血清学试验的血液采集后室温放置1h后，3000r/min离心5min，，分离出血清。

7.3 环境污染标本采集

  水样用于无菌容器采集200ml~500ml，尘土和泥土用于无菌蒸馏水制成悬液。水样中如果含有含氯或其他氧气指示剂，应在取样时或取样前加入硫代硫酸钾或相应的活性试剂中和。从样品采集，浓缩到送检间隔不超过2d，实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析。

7.4 环境污染标本处理

7.4.1 膜过滤法

   采用膜过滤装置进行膜过滤，采用直径47mm~147mm，孔径0.22μm的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加15ml的无菌稀释液或无菌蒸馏水，不断摇动至少2min。也可将容器放入超声波中10，min。

7.4.2 离心法

  取200ml样品于300nl~500ml容器的离心瓶中，6000r/min离心10min或3000r/min离心30min,保持温度在15℃~25℃，弃去上清液，将沉淀物悬浮在15ml无菌蒸馏水中。

7.5 酸处理和热处理

7.5.1 处理目的

  为减少痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等正常情况有菌的标本和环境污染的标本中的杂菌生长，标本需进行酸处理或热处理。同一容器内的标本只能选择酸处理或热处理中的一项，两种处理方法不能重复。

7.5.2 酸处理

  取患者痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等标本2ml，转移至有盖无菌试管中。取经7.4处理过的环境污染标本10ml，转移至有盖无菌试管中，3000r/min离心30min,用无菌枪头吸去8ml体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物。每个装有2ml标本的有盖无菌试管中加入8mlpH2.0酸性缓冲液，混匀，室温静置10min。加入碱中和试剂，调至未加酸性缓冲液时的pH值，静置10min，待查。

7.5.3 热处理

  取患者痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等临床标本或环境污染标本2ml，转移至有盖无菌容器中，50℃±1℃水浴处理30min±2min。

8 实验室检验方法

8.1 细菌培养鉴定，见附录B。

8.2 尿液中抗原的检测，采用免疫层析法，按照相应商品化试剂说明书。

8.3 聚合酶链反应（PCR）检测，参见附录D。

8.4 直接荧光抗体染色按照WS195.

8.5 血清学检测按照WS195或按照商品化试剂说明书。

   注：其他符合检测要求的商品化试剂盒，在验证合格后均可参照使用，本标准不做推荐。

9 结果判定与报告

9.1 细菌培养鉴定报告

9.1.1 标本中培养出军团菌，报告“细菌培养检出军团菌”。

9.1.2 BCYEα培养基或GVPC培养基14d内未见可疑菌落，报告“细菌培养14d，位检出军团菌”。

9.2 尿抗原检测报告

9.2.1 尿抗原检测阳性，报告“尿军团菌抗原阳性”。

9.2.2 尿抗原检测阴性，报告“尿军团菌抗原阴性”。

9.3  PCR检验报告

9.3.1  PCR检测阳性，报告“军团菌PCR检测阳性”。

9.3.2  PCR检测阴性，报告“军团菌PCR检测阴性”。

9.4 血清学试验报告

9.4.1 血清学试验阳性，报告“军团菌抗体阳性”。

9.4.2 血清学试验阴性，报告“军团菌抗体阴性”。

10 阳性结果的处置

10.1 细菌分离培养阳性的菌株应传代保存，疫情报告上级主管部门，同时向当地卫生行政主管部门疾病预防控制中心通报。

10.2 血清学检测、尿抗原检测结果阳性或可疑阳性的标本，宜选择直接免疫荧光抗体染色及细菌分离培养和PCR方法进行复检验证。

附录A略。

附录B

细菌培养鉴定

B.1初培养

  将酸处理或热处理的标本3000r/min离心10min，用无菌吸管吸弃上清液，保留1ml重新悬浮沉淀物，正常情况无菌的标本直接用于培养，用无菌吸管吸取沉淀物悬液或正常的标本，分别滴加1滴~2滴在BCYEα军团菌专用培养基和GVPC选择性培养基上，划线接种或涂布接种。35℃，5%CO2培养箱中培养，连续观察3d~7d，军团菌在BCYEα培养基上菌落通常呈现白色、灰色、蓝色、紫色，但也可能出现棕色粉色灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。发现上述菌落即为军团菌可疑菌落，进行下一步分离培养鉴定。无可疑菌落，培养顺延至14d，报告“细菌培养14天，未检出军团菌”。

B.2 分离培养

  挑取初培养可疑菌落分别在BCYEα培养基和BCYE-Cys培养基或血平板上划线接种。35℃，5%CO2培养箱中培养，观察2d~4d，在BCYEα培养基上见到菌落形成而BCYE-Cys培养基或血平板上未见生长，即初步判定为军团菌，用军团菌诊断血清做分型试验进一步验证。聚合酶链反应可辅助用于军团菌到鉴定，作为参考。

附录C略。

附录D略。

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