一、目的要求：
了解食用菌孢子分离的方法，操作技术以及应用。
二、材料和用具
孢子收集器、75%酒精、0.25%的新洁尔灭、蘑菇、平菇子实体、接种针等。
三、方法和步骤
在无菌操作操作下使孢子在适宜的培养基上萌发，长成菌丝体而获得纯菌种的方法称为孢子分离法。其特点是：菌丝菌龄短，因是有性繁殖产物，其菌丝生命力强。侵染病毒的菌类可用孢子分离法脱毒。在一般菌种分离中，为了避免异宗接合的菌类如香菇、平菇产生单孢子不孕现象，一般都采用多孢分离法。单孢分离法主要应用于食用菌的杂交育种。但双孢蘑菇、草菇等同宗接合菌类可采用单孢分离法。
1．种菇的选择
在生产中必须选择优良品系中的优良个体作分离材料。
2．孢子采集方法
(1)孢子弹射分离法   它是利用孢子能自动弹射出子实体层的特性来收集孢子。收集有几种不同的装置。
①整菇插种法，需用一套孢子收集器(图25-1)来收集孢子，将钟罩上的孔加上棉塞或包上6~8层纱布，放在垫有4~6层纱布(浸过0.1%升汞液)的塘瓷盘上，纱布上放一培养器，内放一个不锈钢支架。把收集器包装好，灭菌备用。将菌幕未破裂的成熟子实体洗干净，用0.1%升汞溶液或0.25%的新洁尔灭浸泡2~3min，以杀死表面的杂菌。对于菌幕破裂、子实层已外露的子实体或无菌幕包裹的子实体，可用棉花蘸75%酒精涂擦子实体表面消毒。按无菌操作要求移入孢子收集器，插在支架上，在适宜的温度中培养。2~3天后孢散落在培养皿中，加入无菌水，用针筒吸取孢子液，接种在斜面培养基中央，置于22～26℃恒温箱中培养即可。
②钩悬法（图25—2），在生产上，采集木耳、银耳孢子常用此法，伞菌也可采用此法。先将新鲜成熟的耳片用无菌水冲洗，然后用无菌纱布将水吸干，取一小片挂在灭菌的钩子上（伞菌则消毒后挂上），钩子的另一端挂在三角瓶口，瓶内装有培养基，在25℃下培养24h。孢子落到培养基上后，取出耳片，塞上棉塞继续培养，然后再转入试管中培养。
③贴附法，取一小块成熟的菌褶或小块菌盖，用溶化的琼脂或胶水、浆糊(需先灭菌)贴附在试管斜面的上方或培养皿皿盖上，经6-12h，待孢子落下后，立即将试管或培养皿中的培养基移到另一消毒过的空试管或培养皿中进行培养。
(2)菌褶上涂抹法
将伞菌手实体用75%酒精表面消毒，按无菌操作用接种环直接插入两片菌褶之间，轻轻地抹过褶片表面，然后用划线法涂抹于试管培养基上。
(3)孢子印分离法
取成熟子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在20～24℃静置一天，大量孢子落下形成孢子印，然后移少量孢子在试管培养基上培养。
(4)单孢子分离法
进行单孢子分离后，在人工控制的条件下，便两个优良品系的单孢子进行杂交，从而培育出新品种。
①平板稀释法，挑取少许孢子在无菌水中形成孢子悬浮液，取几滴涂于培养基上，用无菌玻璃三角架推平。经48～72h后，镜检孢子萌发情况。在单个孢子旁做好标记，然后将其转接到斜面培养基上，待菌落长到1cm左右时进行镜检，观察有无锁状联合，初步确定是否是单核菌丝。
②连续稀释法，挑取一定量孢子，经连续稀释后，直到每滴稀释液中只有一个孢子，然后滴入试管中保温培养。当发现单个菌落时，转到新试管中继续培养，并通过镜检以确定是否为单孢菌落。
  
   

 

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