一、实验目的和内容
目的：了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
内容：1、学习斜面传代保藏方法。
2、学习液体石蜡保藏方法。
3、学习沙土管保藏方法。
4、学习冷冻干燥保藏方法。
二、实验材料和用具
细菌、酵母菌、放线菌和霉菌斜面菌；
牛肉膏蛋白胨培养基斜面(培养细菌)，麦芽汁培养基斜面(培养酵母菌)，高氏1号培养基斜面(培养放线菌)，马铃薯蔗糖培养基斜面(培养丝状真菌)。
无菌水、液体石蜡、P2O5、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土)；
无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、三角烧瓶(250mL)。
三、操作步骤
下列各方法可根据实验室具体条件与需要选做。
(一)斜面传代保藏法
l．贴标签   取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。
2．斜面接种  将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。
3．培养  细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。
4．保藏  斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。
保藏时间依微生物种类而不同，酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保存2～6个月，移种一次；而不产芽孢的细菌最好每月移种一次。此法的缺点是容易变异，污染杂菌的机会较多。
(二)液体石蜡保藏法
l．液体石蜡灭菌  在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，12l℃湿热灭菌30min，然后于40℃温箱中放置l4d(或置于105～110℃烘箱中lh)，以除去石蜡中的水分，备用。
2．接种培养   同斜面传代保藏法。
3．加液体石蜡  用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。
4．保藏   棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存。
利用这种保藏方法，霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。
5. 恢复培养  用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，在试管壁上轻靠几下，尽量使油滴净，再接种于新鲜培养基中培养。由于菌体表面粘有液体石蜡，生长较慢且有粘性，故一般须转接2次才能获得良好菌种。
(三)沙土管保藏法
l．沙土处理
(1)沙处理：取河沙经40目过筛，去除大颗粒，加10%HCl浸泡(用量以浸没沙面为宜)2～4h(或煮沸30min)，以除去有机杂质，然后倒去盐酸，用清水冲洗至中性，烘干或晒干，备用。
(2)土处理：取非耕作层瘦黄土(不含有机质)，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目过筛，去除粗颗粒后备用。
2．装沙土管  将沙与土按2：1，3：1或4：1(W/W)比例混合均匀装入试管中(10mm×100mm，装置约7cm高，加棉塞，并外包牛皮纸，12l℃湿热灭菌30min，然后烘干。
3．无菌试验  每10支沙土管任抽一支，取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在最适的温度下培养2～4d，确定无菌生长时才可使用。若发现有杂菌，经重新灭菌后，再作无菌试验，直到合格。
4．制备菌液  用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面上，用接种环轻轻搅动，制成悬液。
5．加样  用1mL吸管吸取上述菌悬液0.1～0.5mL加入沙土管中，用接种环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。
6．干燥  将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5作为干燥剂，可再用真空泵连续抽气3～4h，加速干燥。将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。
7．保藏  沙土管可选择下列方法之一来保藏：
(1)保存于干燥器中；
(2)用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；
(3)将沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；
(4)将沙土管装入有CaCl2等干燥剂的大试管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蜡封口，放入冰箱中或室温下保存。
8．恢复培养  使用时挑取少量混有孢子的沙土，接种于斜面培养基上，或液体培养基内培养即可，原沙土管仍可继续保藏。
此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌，可保存2年左右。但不能用于保藏营养细胞。
(四)冷冻干燥保藏法
1．准备安瓿管  选用内径5mm，长10.5cm的硬质玻璃试管，用10%HCl浸泡8～10h后用自来水冲洗多次，最后用去离子水洗1～2次，烘干，将印有菌名和接种日期的标签放人安瓿管内，有字的一面朝向管壁。管口加棉塞，121℃灭菌30min。
2．制备脱脂牛奶  将脱脂奶粉配成20%乳液，然后分装，121℃灭菌30min，并作无菌试验。
3．准备菌种 选用无污染的纯菌种，培养时间，一般细菌为24～48h，酵母菌为3d，放线菌与丝状真菌7～10d。
4．制备菌液及分装  吸取3mL无菌牛奶直接加入斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动菌落，再用手摇动试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。用无菌长滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL。
5. 预冻 将安瓿管外的棉花剪去并将棉塞向里推至离管口约15mm处(图24—2A)，再通过乳胶管把安瓶管连接于总管的侧管上，总管则通过厚壁橡皮管及三通短管与真空表及干燥瓶、真空泵相连接(图24—1)，并将所有安瓶管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中，(此时槽内温度可达-40～-50℃)，只需冷冻1h左右，即可使悬液冻结成固体。
6. 真空干燥   完成预冻后，升高总管使安瓿管仅底部与冰面接触，(此处温度约-10℃)，以保持安韶管内的悬液仍呈固体状态。开启真空泵后，应在5～15min内使真空度达66.7Pa以下，使被冻结的悬液开始升华，当真空度达到26.7～13.3Pa时，冻结样品逐渐被干燥成白色片状，此时使安瓿管脱离冰浴，在室温下(25~30℃)继续干燥(管内温度不超过30C)，升温可加速样品中残余水分的蒸发。总干燥时间应根据安瓿管的数量，悬浮液装量及保持剂性质来定，一般3~4h即可。
7．封口样品  干燥后继续抽真空达1.33Pa时，在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精喷灯火焰灼烧，拉成细颈并熔封(图24-2B、C)，然后置4℃冰箱内保藏。
8．恢复培养   用75%乙醇消毒安瓿管外壁后，在火焰上烧热安瓿管上部，然后将无菌水滴在烧热处，使管壁出现裂缝，放置片刻，让空气从裂缝中缓慢进入管内后，将裂口端敲断，这样可防止再用无菌的长颈滴管吸取菌液至合适培养基中，放置在最适温度下培养。
冷冻干燥保藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素(低温、干燥和缺氧等)，是目前最有效的菌种保藏方法之一。保存时间可长达10年以上。
四、注意事项
1．从液体石蜡封藏的菌种管中挑菌后，接种环上带有油和菌，故接种环在火焰上灭菌时要先在火焰边烤干再直接灼烧，以免菌液四溅，引起污染。
2．在真空干燥过程中安瓿管内样品应保持冻结状态，以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢。
3．熔封安瓿管时注意火焰大小要适中，封口处灼烧要均匀，若火焰过大，封品处易弯斜，冷却后易出现裂缝而造成漏气。
五、演示
1．冷冻真空干燥装置的连接及使用。
2．熔封安瓿管操作。
六、实验报告
七、问题和思考
1．如何防止菌种管棉塞受潮和杂菌污染？
2．冷冻干燥装置包括哪几个部件？各个部件起什么作用？
3．现有一个纤维素酶的高产霉菌菌株，你选用什么方法保存？试设计一个实验方案。
  
   

 

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