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微生物菌种保藏



录入时间:2008-10-21 13:36:07 来源:google

 一、实验目的和内容
目的:了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
内容:1、学习斜面传代保藏方法。
2、学习液体石蜡保藏方法。
3、学习沙土管保藏方法。
4、学习冷冻干燥保藏方法。
二、实验材料和用具
细菌、酵母菌、放线菌和霉菌斜面菌;
牛肉膏蛋白胨培养基斜面(培养细菌),麦芽汁培养基斜面(培养酵母菌),高氏1号培养基斜面(培养放线菌),马铃薯蔗糖培养基斜面(培养丝状真菌)。
无菌水、液体石蜡、P2O5、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土);
无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、三角烧瓶(250mL)。
三、操作步骤
下列各方法可根据实验室具体条件与需要选做。
(一)斜面传代保藏法
l.贴标签   取各种无菌斜面试管数支,将注有菌株名称和接种日期的标签贴上,贴在试管斜面的正上方,距试管口2~3cm处。
2.斜面接种  将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上,细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞,而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。
3.培养  细菌37℃恒温培养18~24h,酵母菌于28~30℃培养36~60h,放线菌和丝状真菌置于28℃培养4~7d。
4.保藏  斜面长好后,可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌,管口棉花应用牛皮纸包扎,或换上无菌胶塞,亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。
保藏时间依微生物种类而不同,酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保存2~6个月,移种一次;而不产芽孢的细菌最好每月移种一次。此法的缺点是容易变异,污染杂菌的机会较多。
(二)液体石蜡保藏法
l.液体石蜡灭菌  在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,12l℃湿热灭菌30min,然后于40℃温箱中放置l4d(或置于105~110℃烘箱中lh),以除去石蜡中的水分,备用。
2.接种培养   同斜面传代保藏法。
3.加液体石蜡  用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上,加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。
4.保藏   棉塞外包牛皮纸,将试管直立放置于4℃冰箱中保存。
利用这种保藏方法,霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右,酵母菌可保藏1~2年,一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。
5. 恢复培养  用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种,在试管壁上轻靠几下,尽量使油滴净,再接种于新鲜培养基中培养。由于菌体表面粘有液体石蜡,生长较慢且有粘性,故一般须转接2次才能获得良好菌种。
(三)沙土管保藏法
l.沙土处理
(1)沙处理:取河沙经40目过筛,去除大颗粒,加10%HCl浸泡(用量以浸没沙面为宜)2~4h(或煮沸30min),以除去有机杂质,然后倒去盐酸,用清水冲洗至中性,烘干或晒干,备用。
(2)土处理:取非耕作层瘦黄土(不含有机质),加自来水浸泡洗涤数次,直至中性,然后烘干,粉碎,用100目过筛,去除粗颗粒后备用。
2.装沙土管  将沙与土按2:1,3:1或4:1(W/W)比例混合均匀装入试管中(10mm×100mm,装置约7cm高,加棉塞,并外包牛皮纸,12l℃湿热灭菌30min,然后烘干。
3.无菌试验  每10支沙土管任抽一支,取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中,在最适的温度下培养2~4d,确定无菌生长时才可使用。若发现有杂菌,经重新灭菌后,再作无菌试验,直到合格。
4.制备菌液  用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面上,用接种环轻轻搅动,制成悬液。
5.加样  用1mL吸管吸取上述菌悬液0.1~0.5mL加入沙土管中,用接种环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。
6.干燥  将含菌的沙土管放入干燥器中,干燥器内用培养皿盛P2O5作为干燥剂,可再用真空泵连续抽气3~4h,加速干燥。将沙土管轻轻一拍,沙土呈分散状即达到充分干燥。
7.保藏  沙土管可选择下列方法之一来保藏:
(1)保存于干燥器中;
(2)用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存;
(3)将沙土管取出,管口用火焰熔封后放入冰箱保存;
(4)将沙土管装入有CaCl2等干燥剂的大试管中,塞上橡皮塞或木塞,再用蜡封口,放入冰箱中或室温下保存。
8.恢复培养  使用时挑取少量混有孢子的沙土,接种于斜面培养基上,或液体培养基内培养即可,原沙土管仍可继续保藏。
此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌,可保存2年左右。但不能用于保藏营养细胞。
(四)冷冻干燥保藏法
1.准备安瓿管  选用内径5mm,长10.5cm的硬质玻璃试管,用10%HCl浸泡8~10h后用自来水冲洗多次,最后用去离子水洗1~2次,烘干,将印有菌名和接种日期的标签放人安瓿管内,有字的一面朝向管壁。管口加棉塞,121℃灭菌30min。
2.制备脱脂牛奶  将脱脂奶粉配成20%乳液,然后分装,121℃灭菌30min,并作无菌试验。
3.准备菌种 选用无污染的纯菌种,培养时间,一般细菌为24~48h,酵母菌为3d,放线菌与丝状真菌7~10d。
4.制备菌液及分装  吸取3mL无菌牛奶直接加入斜面菌种管中,用接种环轻轻搅动菌落,再用手摇动试管,制成均匀的细胞或孢子悬液。用无菌长滴管将菌液分装于安瓿管底部,每管装0.2mL。
5. 预冻 将安瓿管外的棉花剪去并将棉塞向里推至离管口约15mm处(图24—2A),再通过乳胶管把安瓶管连接于总管的侧管上,总管则通过厚壁橡皮管及三通短管与真空表及干燥瓶、真空泵相连接(图24—1),并将所有安瓶管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中,(此时槽内温度可达-40~-50℃),只需冷冻1h左右,即可使悬液冻结成固体。
6. 真空干燥   完成预冻后,升高总管使安瓿管仅底部与冰面接触,(此处温度约-10℃),以保持安韶管内的悬液仍呈固体状态。开启真空泵后,应在5~15min内使真空度达66.7Pa以下,使被冻结的悬液开始升华,当真空度达到26.7~13.3Pa时,冻结样品逐渐被干燥成白色片状,此时使安瓿管脱离冰浴,在室温下(25~30℃)继续干燥(管内温度不超过30C),升温可加速样品中残余水分的蒸发。总干燥时间应根据安瓿管的数量,悬浮液装量及保持剂性质来定,一般3~4h即可。
7.封口样品  干燥后继续抽真空达1.33Pa时,在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精喷灯火焰灼烧,拉成细颈并熔封(图24-2B、C),然后置4℃冰箱内保藏。
8.恢复培养   用75%乙醇消毒安瓿管外壁后,在火焰上烧热安瓿管上部,然后将无菌水滴在烧热处,使管壁出现裂缝,放置片刻,让空气从裂缝中缓慢进入管内后,将裂口端敲断,这样可防止再用无菌的长颈滴管吸取菌液至合适培养基中,放置在最适温度下培养。
冷冻干燥保藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素(低温、干燥和缺氧等),是目前最有效的菌种保藏方法之一。保存时间可长达10年以上。
四、注意事项
1.从液体石蜡封藏的菌种管中挑菌后,接种环上带有油和菌,故接种环在火焰上灭菌时要先在火焰边烤干再直接灼烧,以免菌液四溅,引起污染。
2.在真空干燥过程中安瓿管内样品应保持冻结状态,以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢。
3.熔封安瓿管时注意火焰大小要适中,封口处灼烧要均匀,若火焰过大,封品处易弯斜,冷却后易出现裂缝而造成漏气。
五、演示
1.冷冻真空干燥装置的连接及使用。
2.熔封安瓿管操作。
六、实验报告
七、问题和思考
1.如何防止菌种管棉塞受潮和杂菌污染?
2.冷冻干燥装置包括哪几个部件?各个部件起什么作用?
3.现有一个纤维素酶的高产霉菌菌株,你选用什么方法保存?试设计一个实验方案。
  
   

 

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