一、实验目的和内容
目的：学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法，了解乳酸菌的生长特性。
内容：1．从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化。
2．乳酸发酵及检测。
3．乳酸菌饮料制作。
4．自制乳酸质量品尝。
二、实验材料和用具
嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)，乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离；
BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基、脱脂乳试管(见注)、脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖、碳酸钙；
恒温水溶锅、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶(200～280mL,)、培养皿、试管、300mL三角瓶。
三、操作步聚
(一)乳酸菌的分离纯化
1．分离 取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5，，取其中的10-4、10-52个稀释度的稀释液各0.1～0.2mL，分别接入BCG 牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
2．鉴别 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8～24h若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。
(二)乳酸发酵及检测
1．发酵 在无菌操作下将分离的1株乳酸菌接种于装有300mL 乳酸菌培养液的500mL三角瓶中，40～42℃静止培养。
2．检测 为了便于测定乳酸发酵情况，实验分2组。一组在接种培养后，每6～8h取样分析，测定pH值。另一组在接种培养24h后每瓶加入CaCO3 3g(以防止发酵液过酸使菌种死亡)，每6～8h取样，测定乳酸含量(方法见注)，记录测定结果。
(三)乳酸菌饮料的制作
1．将脱脂乳和水以1:7～10(WW)的比例，同时加入5%--6%蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～5min，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。
2．将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2%～5%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3～5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。
3． 把接种后的酸乳瓶置于40--42℃恒温箱中培养3～4h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH4～4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。
4．以品尝为标准评定酸乳质量 采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。比较项目按表22-1。
四、注意事项
1. 采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。
2．制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌，采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风味和良好口感。
3．牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。
4．作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。经品尝和检验，合格的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保存6～7d。
五、实验报告
1．乳酸发酵过程、检测结果及结果分析。
表22—1 乳酸菌单菌及混合菌发酵的酸乳品评结果
2．将发酵的酸乳品评结果记录于表22—1中；
六、问题和思考
1、发酵酸乳为什么能引起凝乳？
2．为什么采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味更佳？
3．试设计一个从市售鲜酸乳中分离纯化乳酸菌的制作乳酸菌饮料的程序。
注：
（一）脱脂乳试管
直接选用脱脂乳液或按脱脂乳粉与5%蔗糖水为1：10的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min .
（二）乳酸检测方法
1．定性测定 取酸乳上清液的10mL于试管中，加入10% H2SO4 1mL，再加2% KMnO4 1mL，此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸溶液中浸泡的滤纸条搭在试管口上，微火加热试管至沸，若滤纸变黑，则说明有乳酸存在，这里因为加热使乙醛挥发的结果。
2．定量测定:
(1)测定方法:取稀释10倍的酸乳上清液0.2mL，加至3mL pH9.0的缓冲液中，再加入0.2mL NAD溶液，混匀后测定OD340nm值为A1，然后加入0.02mL L(+)LDH，0.02 D(一)LDH，25℃保温lh后测定OD340nm值为A2。同时用蒸馏水代替酸乳上清液作对照，测定步骤及条件完全相同，测出的相应值为Bl和B2。
（3）测定乳酸试剂的配制(见附录)
3．酸乳的检查指标 ①感观指标：酸乳凝块均匀细腻，色泽均匀无气泡，有乳酸特有的悦味；②合格的理化指标：如脂肪≥3%，乳总干物质≥11.5%，蔗糖≥5.00%，酸度70～110Tº，Hg﹤0.01×10-6mg/mL等；③无致病菌，大肠菌群≤40个/100m L。
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