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细菌的镜检



录入时间:2015-6-12 9:33:58 来源:青岛银河澳门官网入口

细菌的镜检的项目有细菌的形态、大小、革兰氏染色反应,有无芽孢、荚膜、鞭毛以及细胞运动情况等。

1、细菌的制片方法:在镜检前必须将被检物制成玻片标本,才能观察,用于标本的玻片应非常干净。

根据被检物所要检查的项目和供检材料的不同,其制片方法有以下三种:

①普通法(压片法):用普通法制作活细菌标本,不但便于观察细菌的运动,而且还能观察细菌的形状、大小和芽孢。其方法是:在干净的载玻片上滴一滴蒸馏水,用接种环挑取一环供检材料放入水中并混匀,若供检材料为液体而不太浓时,则不必加水。然后加放盖玻片,在盖片时,应先把盖片的一端放在载玻片上,再慢慢向下压盖,勿使水从该玻片边缘溢出。同时避免发生气泡,然后用干净的玻璃棒等使盖片紧贴在载玻片上。

为了便于观察,可用美蓝或复红等染色液代替谁使用,将细菌染成蓝色或红色,然后把盖玻片盖上,在进行镜检,这样看的较为清晰。

②悬滴法:悬滴法用于观察生活状态的细菌,如细菌的运动、繁殖方式、孢子萌发等。其方法是:取一滴蒸馏水或培养液于干净的盖玻片中央,再取一环培养好的菌体,接种于盖玻片的液滴中,然后将盖玻片翻转过来,盖于凹玻片的凹窝中,使菌液正好倒垂在载玻片的凹窝中央,不要使水滴碰到凹窝的壁和底。为防止干燥,在盖玻片边沿上涂上凡士林,使菌液紧紧处在密闭的小室中,即可镜检。因为没有染色的活细菌是透明的,不易看到,必须降低聚光器或缩小光圈,以减少照明强度,认真观察,才能得到良好效果,若观察其繁殖或孢子萌发时,需将带有悬滴的玻片放在底部铺有湿纸或湿棉的培养皿中,以便保湿,盖好皿盖进行定温培养,而后镜检。

涂片法:涂片法适用于细菌结构的观察,其方法是:首先在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水,用灭菌的接种环取少许菌体,放在载玻片上,与水混合涂成直径约为1cm的均匀薄片,即成涂片。用这种涂片法制的标本在显微镜下一般不直接看,经染色后才能看得清晰。

2、细菌的染色方法:由于细菌个体透明,在光学显微镜下不易观察到其形态,必须借助于染色的方法使菌体着色,增加与背景的明暗对比,才能在光学显微镜下较为清楚地观察其个体形态和部分结构。

按照所用染料种类的不同,可将染色法分成两大类:单染色法和复染色法。

单染色法又称普通染色法,只用一种染料染色,适用于菌体一般形态观察。操作过程为:按涂片法制成的涂片,进行固定,固定方法有自然干燥或加温干燥。通常采用加温固定,可在酒精灯火焰上快速来回烘烤涂片背面,以手摸载片发烫时为宜。在固定好的玻片上加染色液1~2滴(吕氏美蓝或碱性复红液),使其盖满玻片,静止1~2min。用细小水流慢慢冲去染料,再用吸水纸吸去玻片上的水分,待晾干后即可镜检。

复染色法(革兰氏染色法)又称鉴别染色法,是用两种或多种染料进行染色,有帮助鉴别细菌之用。最常用的为革兰氏染色法。染色结果,菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌(G+),红色者为革兰氏阴性菌(G-

其操作步骤如下:

①涂片固定:取培养24~48h的细菌按单染色法涂片固定。

②初染:滴加结晶紫液,全部覆盖于涂片上,染色1min后,用细水流冲洗,而后用吸水纸轻轻吸干。

媒染:加路氏碘液,1min后水洗,同样用吸水纸吸干。路氏碘液是一种媒染剂,具有助染作用。

④脱色:加95%(体积分数)酒精经10~30秒后,水洗,同样用吸水纸吸干。

复染:加石炭酸复红液染0.5min后,水洗,吸干。即可在油镜下镜检。

在进行革兰氏染色过程中,以涂片和酒精脱色这两步最为关键。涂片切不可过于浓厚,要求薄而均匀。过于密集的细菌涂片常常影响脱色结果,而呈现假阳性反应。95%(体积分数)酒精,这种脱色剂,脱色能力很强,所以要求脱色时应恰当掌握。脱色过轻,阴性菌脱色不掉紫色会造成假阳性;若脱色过重,阳性菌的紫色也会被脱掉而造成假阴性。

此外,革兰氏染色的结果还与菌龄有关。一般幼龄菌的革兰氏染色反应比较正常,老龄菌的革兰氏染色反应常有变化,特别是革兰氏阳性菌,在老龄时常是阴性反应。因此,革兰氏染色所用的菌种一般是24~48h的培养物。

3、细菌芽孢、荚膜、鞭毛染色法:细菌芽孢染色法:芽孢染色法是利用细菌和菌体对染料的亲和力不同的原理,用不同染料进行着色,使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别,芽孢壁厚、透性低,着色、脱色均较困难。因此,当先用一弱碱性染料,如孔雀绿或碱性品红,在加热条件下进行染色时,此染料不仅可以进入菌体,而且也可以进入芽孢。进入菌体的染料可经水洗脱色,而进入芽孢的染料则难以透出。若再用复染液(如番红液)或衬托液(如黑色素)处理,则菌体和芽孢易于区分。其操作过程如下:

①将培养24h左右的芽孢杆菌作涂片、干燥、固定。

②滴加3~5滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上。

用木夹夹住载玻片在火焰上加热,使染液冒蒸汽,但勿沸腾。切忌时染液蒸干,必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽开始约4~5min。

④倾去染液,待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

用番红水溶液复染1min,水洗。

待干燥后,置油镜观察,芽孢呈绿色,菌呈红色。

 

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