第6章  微生物挑战实验

1. 简介

微生物挑战实验已经并将继续是确定食品是否支持腐败微生物或病原体生长能力的一个有用工具。微生物挑战实验还是针对靶生物或一组靶生物具有杀伤力过程能力验证的重要手段。通常，实验后的目的是必然发布一个有关杀伤力过程的性能指标（例如：对发酵肉制品中大肠杆菌O157：H7减少5个对数值）。设计适当的微生物挑战实验将验证具体过程是符合预定的性能指标。微生物挑战研究的设计、实施和评估是一个复杂的任务，取决于相关的产品是如何开发、制造、包装、交付、制备和消费等因素。微生物学家必须考虑前述的相关因素，并设计一项食品安全评估最佳的方案。未能考虑特定的产品和环境因素的实验方案，会导致有缺陷的结论。

微生物挑战实验对确定一些冷藏或室温保存的食品潜在货架寿命是有用的。确定挑战实验是否适当或有用必须考虑的因素：如产品支持腐败微生物或病原体生长的可能性，或之前对产品的认知。例如：对冷冻食品进行挑战实验是没有意义的，因为其在合适的储存条件下不支持微生物生长；而对于罐头食品进行挑战实验来反推商业无菌是特别有用的。但是，以罐头食品为例，它或许适于作为过程验证的部分方案来进行接种组的研究。对于支持病原微生物生长的食品，在冷藏、温度回升或处于环境温度下时，则易于受到微生物生长的危害，进行微生物挑战实验是非常有用的。

在进行微生物挑战实验时，许多因素必须考虑(Vestergaard 2001)。这包括：1）适当的病原体或替代物的选择， 2）挑战接种的水平，3）接种物制备和接种的方法，4）实验的持续时间，5）配方的因素和储存条件， 6）样品分析。数据的解析和合格/不合格的标准是评估食品安全是否需要控制时间/温度的关键。

而微生物挑战实验对确定产品配方是否能抑制产品潜在腐败是有用的，本章其余部分的讨论将侧重于对相关的食品病原体通过控制时间/温度以保障食品安全。

2. 挑战实验用微生物的选择

表6-1列出了用于各种类型食品挑战实验用的一些病原体(Vestergaard 2001)。食品配方知识和食品的历史（例如：联想到已知的疾病暴发和/或潜在的增生证据）对选择适当的挑战病原体时是必不可少的。例如：某些气调包装（MAP）的产品要关注肉毒梭菌，在低AW的产品很少有竞争力的微生物，就需要关注金黄色葡萄球菌。

理想的挑战实验用微生物的是那些先前已经从类似配方食品中分离出来的。此外，还应包括已知的食源性疾病暴发的病原体，以确保配方健全到足以抑制这些微生物为宜。

挑战实验应包括目标致病菌多个特定的菌株。为了说明潜在的菌株变化，用“鸡尾酒”或多种菌株的混合物挑战食品配方是一种典型实验。在一个挑战实验中目标致病菌用5个或更多的菌株是不寻常的。例如：肉毒杆菌挑战实验通常包括几种菌株为蛋白水解A和B型，以及代表非蛋白水解菌株（如果适用）。具有明确良好特征的单菌株用于筛选产品配方挑战实验与过去那些已被自然广泛运用多菌株挑战实验相似。

在此之前进行的挑战实验，相互对立的菌株应进行筛选确定。李斯特菌的某些菌株之间的拮抗作用已有报道，肉毒梭菌的某些菌株与产细菌素的乳酸菌之间也一样有拮抗作用。如果这些不兼容是一个“鸡尾酒”挑战实验的一部分时，那么错误的结果可能会接踵而至。

同样重要的是在标准的条件与规范下培育和制备挑战悬浮液。用于增殖挑战微生物的培养温度和产品储存温度的改变已经显示出改变挑战实验自身（1991 Curiale）的滞后期长度。在接种前必须考虑到挑战用悬浮液要适用食品配方的环境。例如：当接种到酸性食品，在接种前大肠杆菌O157：H7细胞或沙门氏菌细胞耐酸性如何会极大地影响它们的生存能力。

最后，使用基因特征工具（如有的话）非常有助于菌株在挑战实验中的判定，这在缩短实验时间方面是有显著优势的。这类工具如：基因指纹和脉冲场凝胶电泳可以帮助鉴别无论是接种的或天然存在的菌株(Farber等人2001)。挑战用微生物也可被遗传修饰以携带标记物有助于从其它菌株区分开来，并有利于在食品中检测到它们。显然，遗传修饰生物体需要具有与野生型或亲本菌株可比的生理特性。

对于某些应用，替代微生物可用于挑战使用代替特定病原体。例如：它通常是不可能引入病原体进入的加工厂；因此，在这些情况下理想的方式是使用替代的微生物。一个理想的替代是靶病原体菌株，其保存所有其他特征，除了它的毒力外。然而在实践中，许多替代物是密切相关的，但不一定是相同种类的靶病原体。传统的例子包括使用生孢梭菌的作为肉毒杆菌的接种组研究的替代，无害李斯特菌作为单增李斯特菌的替代，大肠杆菌的通用菌株作为大肠杆菌O157：H7的替代。在其后使用中，由于大肠杆菌的通用菌株不具有大肠杆菌O157：H7相同的耐酸性水平，这点必须引起注意。因此，在一个挑战实验中虽然使用大肠杆菌的通用菌株可能是适合以评估高pH值食品的加热过程或防腐体系产生的影响，但用于评估酸性食品使用这些通用菌株是不恰当的。通常，替代从一组良好表征的生物中选择并具有以下所需属性（IFT 2000）：

•非致病性。

•灭活特性和动力学可用于预测那些靶病原体。

•暴露在配方和/或加工参数（例如：pH稳定性、温度敏感性、和氧耐受性）的行为类似于目标病原体。

•稳定和持续增生的特征。

•易于制备成高浓度的菌液。

•一旦制备，菌数量保持稳定直到使用。

•轻松找出可采用的快速、灵敏和便宜的检测系统。

•从背景菌群中能轻松区分。

•模仿那些目标病原体具有的特征。

•基因稳定，在独立的实验室或不同的实验时间结果可被复制。

•如果用于生产区域不会滋生为一个“腐败”的微生物群体。

•敏感性损伤类似于目标病原体。

如果一个替代菌株用于微生物挑战实验，实验之前应做的基础工作是该菌株应具有良好的属性。应确定属性如以上讨论的那些，并通过初步的实验室工作证实以保证替代菌株是适合于预期的目的。仅当特定病原体因安全的原因绝对不能用于产品或人员时才使用替代。

3. 接种量

在微生物挑战实验中使用的接种量取决于研究的目的是否是确定产品的稳定性和保质期或验证在旨在减少微生物数量的加工步骤。通常情况下，产品中接种量在102 - 103个细胞/克之间，以用来确定配方的微生物稳定性。其它产品更高的接种量可能是适当的。根据产品的配方，一些接种的菌株在开始适应环境的初期可能会死光。如果使用太低的接种量时，不正确的假设，会认为该产品是稳定的，事实它不是。相反，如果为此目的接种量过高，不恰当的接种量抹杀了防腐体系或抑制生长的功效，从而导致不正确的结论：配方是不稳定的。当用于验证杀菌工序如加热处理、高压处理或辐照，反而，通常有必要使用高的接种量（例如：106 - 107个细胞/克产品），以表明挑战菌株减少的程度。例如：在美国果汁加工商现在需要证明有关危险的微生物在其产品中减少5个对数值（5D性能指标）。这些对数减少验证方案通常需要使用平板法。在枚举法的统计限内，为了测量减少到这一水平，接种量必须至少为10 6 CFU / g。

4. 接种准备和接种方法

在微生物挑战实验中使用菌种的制备是整体方案的一个重要组成部分。通常情况下，使用冷藏肉汤培养或斜面或冷冻甘油恢复后培养菌种18 - 24小时。挑战用菌种应在培养基中能生长，并处于适于其最佳的培养条件下。在一些实验中，具体挑战微生物适用于特定的条件。为适应特定的食品需要进行调整。例如：在进行酸性食品的挑战实验前，大肠杆菌O157：H7可以使用适当的酸化剂进行酸适用。细菌孢子悬浮液可被存储在冷藏水或冷冻甘油中。接种前将孢子悬浮液用无菌水稀释并立即热休克。肉毒梭菌孢子使用前应彻底清洗，以确保没有肉毒杆菌毒素被带入进行挑战实验的产品中，并且，如果可能的话，孢子应在食物中热休克以进行研究。挑战混悬液定量计数，通过挑战产品中目标接种物的稀释来计算。当使用某些病原体进行挑战实验时，应采用适当的程序和防护设施。

在进行微生物挑战实验时接种的方法是另一个非常重要的考虑因素。经受挑战时必须尽一切努力不改变产品配方的关键参数。有各种接种方法，可以根据受到挑战的产品类型来采用。在含水的液体基质如调味汁和卤汁具有高aw（> 0.96），所面临的挑战接种物可被直接接种到产品中混合，用最小量的无菌水或缓冲液作为载体。在食品中添加使用稀释液调整到产品的大致aw的保湿剂，以最大限度地减少影响食品aw 导致错误结果的可能性。在实验中，其中的湿度水平是实验变量之一，接种物悬浮在水中或液体中用于调节配方的水分含量。对于间歇式接种，所述的接种物可直接加入到混合钵或容器中的产品中。对于独立包装或袋式类型应用，接种物可以使用无菌注射器通过无菌方式注入含有橡胶隔膜的包装壁内。对于aw > 0.96的固体基质，如煮过的面或肉表面，一个替代注射器的方法可以是使用一种雾化器。悬浮于无菌水或缓冲液中的接种物用喷雾器喷洒，将其喷到颗粒产品内或产品的表面。喷撒应在排气罩下来完成，或使用其他保护装置，以避免产生的致病菌导致人员的安全问题。在所有这些应用，应使用最小量的水或缓冲液应用于悬浮接种物。接种物也可以使用一个绒垫、画垫或类似的纤维布按提供的方法来校准，并以最小的湿气转移再现接种物水平。应做基础分析以确保配方的aw或水分含量接种后不改变。对aw <0.92的产品或组份可以用雾化器方法用最小体积的水或缓冲液来接种。产品应始终进行检查，再次强调以确保最终产品aw或水分含量没有被改变。简要：一些产品在最终包装前需要有一个接种后的干燥期。作为选择，它们可以接种已悬浮于载体水或缓冲液中挑战生物添加到无菌砂、面粉或粉末形式的产品（例如：干燥面食），并使其干燥。冻干培养物也可用于某些应用。接种的可行性和增殖水平应提前研究确定。将制备的干燥接种物无菌添加到测试产品，为均匀分布接种物应摇动或彻底搅拌。

应接种足够的产品保障每次采样时至少重复三次，以获得一个全面的挑战实验。在某些情况下，如在一些再验证实验和未接种的对照样品，重复进行的次数可以减少。

5. 实验持续时间

保守的微生物挑战实验至少在产品期望的保质期内进行。更多期待的是，用一个完整的预期望保质期加上超出预期保质期的一个余量的产品进行挑战实验；如果用户将持有并消费超出其预期保质期的产品，因为通过实验确定其会发生什么，这点非常重要。一些管理机构要求至少在预期的保质期数据上加上至少三分之一。

影响挑战实验持续时间的另一个考虑的因素是产品储存的温度。在目标的储存温度下冷藏产品其整个保质期均可作挑战实验，但滥用温度条件下，他们通常持有较短时间。

在某些食品服务场所，为方便而将特定冷藏要求食品保存在保质期更短的室温下。例如：一些快餐操作为方便制定一个8小时在室温下存放干酪片的时间。当加工热三明治时，这会使得奶酪会软和融化得更快。然而，由于餐厅操作时的交叉污染，病原体可能存在于干酪片中；因此挑战实验将需要提供证据表明这种做法是安全的。如果餐厅一班次想保存干酪片在室温下达8小时，挑战实验的持续时间至少应为12小时。如果通过餐厅操作造成干酪片交叉污染，进行该挑战实验是为确认病原体的快速增殖不会发生。

因为可能在某些产品会发生接种病菌的亚致死，还希望产品的测试显著超出其整个保质期。在此接种物可能无法培养，这会导致长的滞后期；但随着时间的推移，少数损伤的细胞在产品中又恢复生长。这种反弹或“凤凰涅槃”现象，已经在多项产品中观察到(Jay 1996)。如果产品不是在至少整个保质期内测试，有可能错过在保质期后挑战生物体的复苏和后续生长。

测试的频率由微生物挑战实验的持续时间所约束。为了接种操作有良好的代表性，理想情况在保质期内至少有5-7个数据点。通常情况下，如果保质期的单位是天，测试的频率如果不是每天多次应至少是每天。如果保质期的单位是几个星期或几个月，测试频率一般不少于每周一次。实验首次应该是“零时间”测试，即分析产品接种后就开始测试。对于某些类型的产品，它也可能希望允许有一个平衡期让接种物适应测试前的产品。在挑战实验早期（即：在最初几天或一周）可能需要更频繁地测试（例如：每天或每天多次），然后以较长的时间间隔降低测试的频率。

6.配方因素和储存条件

当评估配方时，了解控制微生物稳定性的关键参数的范围是很重要的。内在因素，例如：pH、aw或防腐水平是防止病原体的生长或防止腐败的关键，将影响到预期保质期内产品的安全性。因此，重要的是要在最坏的条件下测试配方中单独和/或组合的每个关键变量。例如：如果目标pH值是4.8±0.2和在工序能力容许范围内，在该范围内高一端（即，pH值5.0）的挑战产物是重要。同样，如果山梨酸的用量为0.15±0.05％的水平，该挑战产品应为0.10％的低浓度。这个建议，以确保挑战实验覆盖了对配方中的每个关键因素过程能力的范围。相关的固有性质，如pH值、aw和渗透压每次实验应该记录以供将来比较和参考。

试验样品最好应存储在用于市场销售的相同包装内。如果商品是真空或MAP包装，那么在微生物挑战实验中使用的样品应使用相同的包装袋在相同的条件下进行包装。

在微生物挑战实验中使用的储存温度应包括产品在储存和销售过程中典型的温度范围。一个冷藏产品，可能会处在一个差的温度下，那么应在代表差的温度条件下受到挑战。产品可能会处于高湿度环境下，也应在此条件下挑战（Notermans和他人，1993）。有些挑战实验可能将温度循环包含到方案中。例如：制造商在产品部分保质期内可以给产品在一个良好控制的冷藏条件下，在此之后，产品使用前和使用过程中可能随即遭受到高温。

7.样品分析

在微生物挑战实验中，要列出在每个采样点活的挑战微生物典型水平。通常，在每个时间点理想情况是至少应有一式两份、最好一式三份的样品进行分析。在需要较高水平的确定性情况下，应使用一式更多份样品或重复进行实验。选择常见的培养基和培养方法（例如：直接平板接种MPN）依赖于在实验中使用的病原体或替代微生物物的类型。如果产品没有大量的背景微生物，可使用非选择性培养基直接用于增殖。在使用产毒素微生物情况下（例如：金黄色葡萄球菌或肉毒梭菌），使用大多数现行的验证方法在每个时间点应进行适当的毒素测试。可能并不需要在实验的每个时间点都进行毒素水平测试，但在整个产品预期的保质期间要规划较短的时间间隔来进行较多次测试，以确定保质期是否可以接受。在适当情况下，复苏方法可避免产生错误的结果。

谨慎地分析产品，包括未接种的对照样品，在每个或选定的采样点来研究看背景菌群的行为对产品保质期的影响。例如：如果一个产品具有较高的背景菌群，它可能抑制挑战接种物的生长。因为病原体增殖之前的产品变质在一些情况下是有益的、期望的。在其他情况下，背景微生物可能并不普遍存在，会导致一个潜在的安全错觉。此外，在某些情况下，随着时间的推移背景微生物可以改变产品中配方的参数有利于或抑制接种物的生长（例如：霉菌可提高产物的pH；乳酸菌能够降低产品的pH）。

同样重要的是在保质期跟踪产品的相关的物理化学参数，看看它们是如何改变和影响病原体的行为。了解怎样的因素如aw、水分、渗透压、pH值、MAP气体浓度、防腐剂水平和其他变量的行为对产品保质期的影响是认知产品微生物稳定性的关键。

8.数据解读

一旦微生物挑战实验完成后，应分析数据看病原体随时间变化如何表现。数据的趋势分析和适当的图形绘制（即，半对数图）将显示随着时间的变化挑战生物是否死亡、保持稳定或数量增加。对于产毒素的病原体，设定的挑战期间应无毒素被检测到。结合背景微生物及相关的理化数据与每个时间点定量接种数据，这样在配方的微生物学稳定性评价上具有一个有力的证据和广泛的代表性。根据这些数据以形成或调整产品配方，使得在合理的保质期内病原体不易生长。

当使用微生物挑战实验，作为一个过程验证方案的一部分，数据的分析显示过程是否能够达到致死所需的水平（即，符合预先确定的能力标准）。为了满足致死要求，如果必要的话可基于这些信息进行过程调整。

微生物挑战实验的数据可以用于开发微生物预测模型或验证现有的过程。预测模型是基于计算机为基础的方案来模拟或预测配方在特定条件下微生物将怎样表现（例如：pH值、aw、水分、盐和防腐剂）。微生物挑战实验既用来产生这些类型的以实验为依据的模型，也用于验证其适用性。

总体而言，精心设计的挑战实验可以提供一种食品配方的微生物安全性和稳定性的关键信息。验证一个过程关键杀菌能力或微生物控制点其也是非常有价值的。挑战研究非常有助于确定食品是否需要在其整个保质期进行温度控制，或者在其全部或部分保质期内它是否可以保存在室温下。

9.实验通过/失败的标准

选择微生物用于挑战实验和/或挑战模型取决于通过商业经验所获得的知识和/或考虑食品的流行病学资料或由于病原体生长导致类似食品可能产生的危害。另外，产品固有属性（例如：pH值、水活度、和防腐剂）和外在属性（例如：气体、温度和工序）也应该加以考虑。每种微生物的危险特性随着显著的增殖而不同。例如：传染性病原体的生长应当保持控制，多数情况下只有经过大量增殖才会产生毒素而导致危害。在适当控制的情况下，产毒微生物的生长并不能导致健康危险，但将要产毒。

经过小组的推荐、合理的选择和增殖限评估后，下面所列微生物可用于微生物挑战实验。

为了安全，对于产毒霉菌如曲霉属、青霉属和镰刀菌需要控制时间/温度，因霉菌变质的食品可以辨识以防止被食用，所以不推荐用于挑战研究。 

蜡样芽胞杆菌：不能形成毒素是选择它的关键。由于毒素测量是困难的，因此需要控制时间/温度以达成接种水平3个对数值内的增殖。这种增殖极限确定是基于以下情况：

•  蜡样芽孢杆菌的典型初始水平较低；因此，基于文献中1000CFU/g是一个保守的初始水平。

•  菌群数达到>106 CFU/g的水平，会产生危害健康的毒素（2001年FDA）。

•  蜡样芽孢杆菌的致吐毒素具有热稳定性；因此，消减是不可能的。

其他注意事项：

•  蜡状芽孢杆菌孢子对热都相对敏感。用于面包产品烘焙可能会杀灭其在面粉中低水平存在（Kaur 1986）；然而，已经报道在南瓜派中发现其不寻常的高耐热性（Wyatt and Guy 1981）。对特定产品应该进行蜡样芽孢杆菌生存潜力的评估。

•  历史上蜡样芽胞杆菌食源性疾病与米饭和土豆有关联，因此含米饭或土豆的产品应评估时间/温度的控制要求。

弯曲杆菌：不推荐用于挑战实验，因为其它微生物如沙门氏菌与其有类似的污染路径，而且更容易培养，也不需要复杂的营养物。此外，弯曲杆菌最低生长温度32℃（90°F）和水分活度0.98，使它不太可能成为挑战使用的候选对象。

肉毒杆菌：推荐的要求在目前的方法下毒素不可以形成。其他注意事项：对特定的熟制品要适当考虑肉毒梭菌，尤其是MAP包装产生的无氧和微氧条件下的产品；如浸油食品和焙烤马铃薯都曾暴发过此类食源性疾病。

产气荚膜梭菌：一个 3个对数值的增殖基于下列因素：

•  虽然其他产品可能含有存活的孢子，与产气荚膜梭菌相关的主要是肉禽制品，包括酱和调味肉汁。依据食品法典大部分生鲜产品要求熟制。

•  肉禽制品内的产气荚膜梭菌营养细胞很容易被烹调杀灭，而孢子由于形成条件苛刻通常含量较低。在平板上培养一个最差的情况下初始水平为100CFU/ g。增殖到> 105CFU / g会导致食源性疾病；因此为控制危害增殖不能超过3个对数值。

肠出血性大肠杆菌：如果预测病原体增殖用模型程序，因该微生物的感染性应保持储存的时间/温度条件使肠出血大肠杆菌在迟滞期。然而，如果用于实验室挑战实验时， <1个对数值的渐进生长作为定量方法自身的变异指示增殖已被控制。

李斯特氏菌：最近的风险评估（FDA / USDA 2001）表明，较低水平的单增李斯特氏菌对公众健康呈现低风险。认识到这一点，一些国家如：加拿大和德国建立了允许这种微生物在某些即食食品中低水平存在，但不许增殖到很高的水平。然而，在美国对这些类型的食品尚未建立一个李斯特氏菌限量。人们还认识到，支持微生物生长的那些产品呈现的风险增加。食用时100 CFU / g的单增李斯特氏菌限量可满足保护消费者一个可接受的水平（Ross and others 2000）。然而，数据不足以确定最坏情况下该菌存在的通常初始水平。总体而言，该小组得出的结论是李斯特氏菌1个对数值的增长控制水平是适当的。这个水平基于枚举技术的变异，代表的观点是该菌高水平的增殖表明会危害到公众健康时必须加以控制。

沙门氏菌：验证恰当地病原体生长模型程序可用于核实沙门氏菌属处在迟滞期内。否则，同肠出血性大肠杆菌一样增殖量应被限制在<1个对数值内。

志贺氏菌：志贺氏菌不推荐用于挑战实验，因为它与沙门氏菌属具有相同的潜在来源，并具有苛刻的生长和生存条件。

金黄色葡萄球菌：评估实验用的时间/温度应不产生可检测到的毒素。目前用于毒素检测的方法和测定特定毒素的含量同肉毒梭菌一样。采用限制增殖<3个对数值来替代毒素测试。这个限制的生长水平是基于初始菌群为1000CFU/ g和最小需要10 6 CFU / g才产生毒素。

其他注意事项：挑战实验用金黄色葡萄球菌是适合的，因为其作为食源性疾病获得广泛地研究。金黄色葡萄球菌不适于与其他微生物竞争；因此，当食品中含有其他高浓度的微生物时，其不适于作挑战实验，如生菜或经过发酵的食品。

弧菌：验证恰当地病原体生长模型程序可用于核实弧菌处在迟滞期内。否则，同大肠杆菌一样增殖量应被限制在<1个对数值内。

副溶血性弧菌：对于海洋食品挑战实验可以用副溶血性弧菌替代其他弧菌。应当指出的是大多数鱼类高度易腐烂，因此控制温度是防止变质的原因。

小肠结肠炎耶尔森菌：不推荐用于沙门氏菌属的挑战实验。小肠结肠炎耶尔森菌和沙门氏菌具有相似的来源，而沙门氏菌更容易培养。

表6-1 各种食品挑战实验中可以考虑采用的病原体

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