一、实验目的和内容
目的：学习和掌握免疫血清的制备方法，为凝集反应和沉淀反应准备凝集素和沉淀素。
内容：1、抗大肠杆菌血清(凝集素)的制备。
2、牛血清白蛋白抗血清(沉淀素)的制备。
二、实验材料和用具
体重2~3kg的健康雄家兔、大肠杆菌(E.  coli)斜面菌种；
牛血清白蛋白(蛋白含量1.5mg/mL)、牛肉膏蛋白胨斜面培养基、0.3%甲醛液(用0.85%生理盐水配制)、75%酒精棉球、碘酒棉球、消毒干棉球；
细菌比浊标准管、无菌吸管、无菌注射器(5mL、20mL)、注射针头(5号，B19)、无菌试管、装有玻璃珠的无菌血清瓶、解剖用具(解剖台、兔头夹、止血钳、解剖刀、眼科剪刀、镊子、动脉夹等)、双面刀片、丝线、玻璃管、胶管、离心机及无菌离心管、普通冰箱、超净工作台、水浴箱。
三、操作步骤
(一)凝集素的制备
1．凝集原(颗粒性抗原)的制备
(1)取37C恒温培养24h的牛肉膏蛋白胨大肠杆菌斜面。
(2)每支斜面菌种中加入5mL0.3%甲醛液，小心地把菌苔洗下制成菌液。
(3)用无菌清洁吸管，吸取以上菌液，注入装有玻璃珠的无菌血清瓶内，振荡10~25min，分散菌块制成菌悬液。
(4)将含菌悬液的血清瓶置于60℃的水浴箱中水浴1h，并不时摇动，把菌杀死。
(5)将菌悬液重新接种至牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，37℃培养24～48h，如有菌生长，则要在60℃水温中再处理。若无菌生长则进行比浊测定其含菌量。
(6)凝集素的制备
(1)免疫方法：选择2～3kg健康雄免，从耳缘静脉采血2mL，分离出血清。该血清与准备免疫用的抗原进行凝集反应，以检查有无天然凝集素。如没有或只有极微量时，该动物便可用来免疫。
最常用的免疫途径是耳缘静脉注射。将家兔放在家兔固定箱内，一手轻轻拿起耳朵，用碘酒棉花球在耳外侧边缘静脉处消毒，然后用酒精棉球涂擦，并用手指轻轻弹几下静脉血管，使其扩张。消毒细菌悬液瓶塞后，用无菌注射器及5号针头吸取菌液，沿着静脉平行方向刺入静脉血管，并慢慢注入菌液，注射完毕，用干棉球按压住注射处，然后拨出针头，并压迫血管注射处片刻，以防止血液向外溢出。注射时发现注射处隆起，不易推进时，表明针尖不在血管中，应拨出针头，重找位置再注射。有时针尖口被堵塞，菌液推不进去，应及时更换针头。注射途径、剂量和日程安排等视抗原和动物不同而有所不同。大肠杆菌免疫家兔的抗原注射剂量和日程安排如下表：
日期 第1日 第2日 第3日 第4日 第5日
注射剂量/mL 0.2 0.4 0.6 1.0 2.0
(2)试血：通常于最后一次注射后7~11d，从兔耳缘静脉抽取2mL血，分离析出血清，用试管凝集反应测定抗血清效价。效价合格即可大量采血，如效价不高，可继续注射抗原免疫，提高效价。
(3)采血：采血分为心脏采血和颈动脉放血。
心脏采血：使免疫家兔仰卧于台上，四肢固定。用左手探明心脏博动最明显处，用碘酒棉球与酒精棉球消毒后，右手握消毒过的20mL注射器和B19号针头，在上述部位的肋骨间隙与胸部呈45°角刺入心脏，微微抽取针筒，此时可发现血液涌入注射器中便可徐徐抽取血液。2.5kg家兔一次可取血20~30mL。取血完毕后，用消毒棉球按压进针处迅速拨出针头，进针处用棉球继续压住。并马上将所采的血液注入无菌大试管内，斜放，待血液凝固后，置于37℃恒温箱中30min，使血清充分析出，然后放入4~6C冰箱中。
颈动脉采血：将免疫家兔固定于兔台上，用少量乙醚麻醉，剪去颈部的毛，然后用碘酒棉球和酒精棉球消毒。沿正中线将颈部皮肤切开到锁骨间，拨开肌膜，暴露出气管，在气管深侧处找到搏动的颈动脉。小心地将颈动脉和迷走神经剥离分开4~5cm。用镊子拉出颈动脉，用丝线扎紧血管的离心端，在血管的向心端用止血钳夹住。然后用眼科剪在丝线与止血钳之间的血管上剪一个V型小切口，将弯咀眼科镊自切口插入，使其张开，同时将一小玻管插入，用丝线扎紧，以防玻管脱漏。玻管另一端接入一条胶管，胶管通入大试管(或大离心管)内，然后将止血钳慢慢松开，使血液流入试管，直至动物死亡，无血液流出为止。
(4)抗血清分离与保存：取凝固血液于4000r/min，离心20min，获得抗血清(即凝集素)。加入石炭酸或硫柳汞使其浓度分别达到0.5%或0.01%。测定抗血清的效价后，封好瓶口，贴好标签，注明抗血清名称、效价及日期，置冰箱保存备用。
(二)沉淀素的制备
抗原为可溶性抗原(如脂多糖、类毒素或可溶性蛋白等)。通常每kg兔体重注射2mg蛋白，牛血清白蛋白抗原浓度为1.5mg/mL，则2.5kg兔应注射5mg蛋白。免疫方法、采血方法和抗血清(沉淀素)的分离可参照凝集素制备方法，但效价测定则用沉淀反应来测定。
四、注意事项
由于每个动物对免疫反应不同，产生的抗体效份有高有低，所以在制备抗血清时至少免疫两只家兔。如须保留该免疫动物，刚采取心脏直接取血，取血后应从静脉注射等体积的50%葡萄糖溶液，经过2~3个月的饲养，方可再次免疫。若不保留动物须一次取大量血时，则采用颈动脉放血法。
五、演示
1．耳缘静脉注射抗原的方法。
2．心脏取血的操作过程。
六、实验报告
1．记录免疫家兔的操作过程及免疫过程中兔的反应。
2．实验操作过程的体会。
七、问题和思考
1．如果不用生理盐水来配制抗原，以这样的抗原免疫兔成不成？为什么？
2．现有一支苏云金杆菌(Bacillus thuringinesis)斜面菌种，你能否制备出相应的凝集素？阐述其主要步骤。
   
   

 

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