一、实验目的和内容
目的：学习培养厌氧微生物的方法，了解厌氧微生物生长的特性。
内容：1、深层穿刺法，厌氧培养丙酮丁醇梭菌。
2、真空干燥器厌氧培养丙酮丁醇梭菌及产气荚膜梭菌。
3、针筒厌氧法培养丙酮丁醇梭菌及产气荚膜梭菌。
4、厌氧罐培养法示范。
5、厌氧袋法培养丙酮丁醇梭菌。
二、实验材料和用具
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。
RCM培养基（即强化梭菌培养基）、TYA培养基、玉米醪培养基、中性红培养基、明胶麦芽汁培养基。CaCO3，焦性没食子酸(即邻苯三酚)、Na2CO3，10%NaOH溶液，0.5%美蓝水溶液，6%葡萄糖水溶液，钯粒(A型)，NaBH4，KBH4，NaHCO3，柠檬酸。
带塞或塑料帽玻璃管(直径18~20mm，长180~200mm)，1mL血浆瓶，250mL血浆瓶，2OmL和50mL针简，250mL三角瓶，试管，厌氧罐，厌氧袋(不透气的无毒复合透明薄膜塑料袋，14cm×32cm)，培养皿，真空泵，带活塞干燥器，氮气钢瓶。
三、操作步骤
(一)真空干燥器厌氧培养法
此法不适用于培养需要CO2的微生物。该法是在干燥器内使焦性没食子酸与氢氧化钠溶液发生反应而吸氧，形成无氧的小环境而使厌氧菌生长。
1．培养基准备与接种 将3支装有玉米醪培养基或RCM培养基的大试管放在水浴中煮沸l0min，以赶出其中溶解的氧气，迅速冷却后(切勿摇动)将其中2支试管分别接种丙酮丁醇梭菌和产气荚膜梭菌。
2．干燥器准备与抽气 在带活塞的干燥器内底部，预先放入焦性没食子酸粉末20g和斜放盛有200mL10% NaOH溶液的烧杯。将接种有厌氧菌的培养管放入干燥器内。在干燥器口上涂抹凡士林，密封后接通真空泵，抽气3~5min，关闭活塞。轻轻摇动干燥器，促使烧杯中的NaOH溶液倒入焦性没食子酸中，两种物质混合发生吸氧反应，使干燥器中形成无氧小环境(图18-lA)
3．观察结果 将干燥器置于37℃恒温箱中培养约7d，取出培养管，分别制片观察菌体特征。
(二)深层穿刺厌氧培养法
此法操作简单，适用于一般厌氧微生物的活化和分离培养，但不能用于扩大培养。
1．接种培养 将玻璃管一头塞上橡胶塞，装入培养基(RCM或TYA培养基)的高度为管长的2/3，套上塑料帽或橡皮塞，灭菌并凝固后，将丙酮丁醇梭菌用接种针穿刺接种(图18—lB)，置37℃恒温箱中培养6～7d。
2．观察结果 观察菌落形态特征并制片于显微镜下观察菌体的细胞形态，并记录结果。
(三)针筒厌氧培养法
此法适于活化厌氧菌和小体积的扩大培养。
1．培养基准备 将灭菌的装有RCM或TYA培养基的血浆瓶放在沸水浴中加热10min，在瓶口胶塞上插上2枚医用针头排气，以赶出残留在培养基内的氧气。随后将血浆瓶从沸水浴中取出，再用氮气钢瓶中的高纯氮气(99.99%)通过胶塞上的一枚针头引人血浆瓶中，使血浆瓶内充满氮气，瓶内培养基在冷却过程中保持无氧状态。
2．针筒装灌培养基 将灭菌的针筒接上针头经胶塞刺人血浆瓶中，先利用瓶内氮气的压力将针筒的推杆慢慢推开，待吸入一定体积的氮气后取下针筒，排尽针筒内的气体。按此重复操作3次，以排尽针筒内的残留空气而维持无氧状态。使血浆瓶口朝下倾斜，利用瓶内压力将培养液缓慢注入针筒内，然后取下针筒，用经灭菌的带孔橡皮塞迅速把针筒头部塞住(图18-2)。
3．接种培养采用无菌操作以菌种液针筒将菌穿刺接入培养液针筒中(图18-3)，置37℃恒温培养，用于菌种活化可培养16~18h，用于测定菌体生长可培养6~7d。
4．观察结果取菌制片观察。
(四)厌氧罐培养法
此法利用透明的聚碳酸酯硬质塑料制成的一种小型罐状密封容器，采用抽气换气法充入氢气，利用钯作催化剂与罐内氧气发生作用达到除氧的目的，同时充入10%(V/V)的CO2以促进某些革兰氏阴性厌氧菌的生长(图18-4)。
其实验操作过程如下：
1．制备厌氧度指示剂 取3mL0.5%美蓝水溶液用蒸馏水稀释至100mL；6mL0.1mol/LNaOH溶液用蒸馏水稀释至l00mL；6g葡萄糖加蒸馏水至l00mL。将上述3种溶液等体积混合，并用针筒注入安瓿管内lmL，沸水浴加热至无色，立即封口即成。取一根直径1cm、长8cm的无毒透明塑料软管，将装有美蓝指示剂的安瓿管置于软管中，制成美蓝厌氧度指示管。
2．培养基准备与接种 将制成无菌无氧的RCM或TYA培养基平板，在无菌操作下迅速划线接种丙酮丁醇梭菌或产气荚膜梭菌，并立即将平皿倒置放入已准备好的厌氧罐中，同时放入一支美蓝厌氧指示剂管。随后及时旋紧罐盖，达到完全密封。
3．抽气换气 将真空泵接通厌氧罐抽气接口(图18-4)，抽真空至表指针0.09~0.093MPa(680~700mmHg柱)时，关闭抽气口活塞，用止血钳夹住抽气橡皮管。打开氮气钢瓶气阀向厌氧罐内充入氮气，当真空表指针返回到零位终止充氮。再接上述步骤抽气和充入氮气，如此重复2~3次，使罐中氧的含量达最低度。最后充入的氮气使真空表指针达0.02MPa(l60mmHg)时停止充氮气。再开启CO2钢瓶阀门，向罐内充入CO2直至真空表指针达到0.011MPa(80mmHg)时停止。为除尽罐内残留的氧，以氢气袋(用医用“氧气袋”灌满氢气)气管连接向厌氧罐内充入氢气直至真空表指针回到零位为止。充气完毕，封闭厌氧罐。
4．恒温培养 将厌氧罐置于37℃恒温箱中培养6~7d，注意罐中厌氧指示剂的颜色变化。
5．观察结果和镜检 从罐内取出平皿，观察菌落特征。并挑取菌落作涂片，用结晶紫染液染色，镜检，比较不同菌的菌体细胞形态特征，并作记录。
(五)厌氧袋培养法
厌氧袋除氧是利用氢硼化钠与水反应产生氢，在催化剂钯的作用下，氢与袋中氧结合生成水达到除氧目的，除氧效果可从袋中厌氧度指示剂观察。同时，利用柠檬酸与碳酸氢钠的作用产生CO2，以有利于需要CO2的厌氧菌的生长。
其反应过程为：
1．厌氧袋 选用无毒复合透明薄膜塑料，采用塑膜封口机或电热法烫制成20×40cm塑料袋。
2．产气管 取一根无毒塑料软管(直径2.0cm，长20cm)，管壁制成小孔，一端封实。天平称取0.4g NaBH4和0.4g NaHCO3，用擦镜纸包成小包，塞入软管底部，其上基入3层擦镜纸，将装有5%柠檬酸溶液3mL的安瓿管塞入塑料管中，管口塞上有缺口的泡沫塑料小塞，即制成产气管。
3．厌氧度指示管 取一根无毒透明塑料软管(直径2cm，长10cm)。量取0.5%美蓝水溶液3mL，用蒸馏水稀释至100mL；取0.lmol/LNaOH溶液6mL，用蒸馏水稀释至100mL；称取6g葡萄糖加蒸馏水稀释成100mL。将上述3种溶液等量混合后取2mL装入安瓿管，经沸水浴加热至无色后立即封口，即为厌氧度指示管。
4．催化剂和吸湿剂 催化剂钯粒(A型)10~20粒加热活化，随后装入带孔的小塑料硬管内，制成钯粒催化管。取变色硅胶少许，用滤纸包好塞入带孔塑料管内，为吸湿剂管。
5．培养基准备和接种 将灭菌的中性红培养基和CaCO3明胶培养基分别在沸水浴中煮沸10min，以赶出其中溶解的氧，冷却至50C左右倒平板，冷凝后接种丙酮丁醇梭菌。随后立即将平皿放入厌氧袋中，每袋可倒置平放3个平皿。
6．封袋除氧和培养 将产气管、厌氧度指示管、钯粒催化剂管和吸湿剂管分别放入袋中平皿两边，尽量赶出袋中空气，用宽透明胶带将袋口封住，用一根lcm宽、与袋口宽等长的有机玻璃条或小木条将袋口卷折2~3层，用夹子夹紧，严防漏气(图18-5)。使袋口倾斜向上，随后隔袋折断产气管中的安瓿管颈，使试剂反应产生H2和CO2，H2在钯粒催化下与袋内O2化合生成水。经5~l0min左右，钯粒催化管处升温发热，生成少量水蒸汽。在折断产气管半小时后，隔袋折断厌氧度指示管中的安瓶管颈，观察指示剂不变蓝，表明袋内己形成厌氧环境。此时将厌氧袋转入37℃恒温箱中培养6~7d。
7．观察结果和镜检 从袋中取出平皿观察菌落特征。丙酮丁醇梭菌在中性红平板上显示黄色菌落，挑取典型单菌落涂片染色后进行镜检，观察菌体细胞形态特征，并作记录。
四、注意事项
1．培养需要CO2的厌氧菌时，须在厌氧小环境中供应CO2。
2．氢气是危险易爆气体，使用氢气钢瓶充氢时，应严格按操作规程进行，切勿大意，严防事故。
3．选用干燥器、针筒、厌氧罐或厌氧袋时，应事先仔细检查其密封性能，以防漏气。
4．已制备灭菌的培养基在接种前应在沸水浴中煮沸10min，以消除溶解在培养基中的氧气。
5．针筒培养液刃天青指示剂出现红色，表明有残留氧气。厌氧袋和厌氧罐中美蓝厌气度指示剂变成蓝色，表明除氧不够。
6．产气荚膜梭菌为条件致病菌，防止进入口中和沾上伤口。
五、演示
1．显示深层穿刺厌氧培养的厌氧菌菌落特征及生长情况。
2．选用真空干燥器、针筒、厌氧罐或厌氧袋厌氧培养法，演示该方法的操作过程，特别是厌氧罐的抽气换气和厌氧袋的封袋除氧操作过程。
六、实验报告
1．实验中选用厌氧培养法的培养结果：
2．试比较以上厌氧培养方法的优缺点，并分析其成功的关键。
七、问题和思考
1．请设计一个试验方案，如何从土壤中分离、纯化和培养出厌氧菌。
2．试举例说明研究厌氧菌的实际意义。
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