方法一：基准法—6.5℃，培养10天（仲裁法）（IDF标准101A：1991）

1 适用范围：适用于原奶和巴氏杀菌奶的检验。

2 方法提要

2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。。

2.2 将培养皿在6.5℃条件下培养10天。

2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数，选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。

3试剂

3.1 稀释液

生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液，灭菌。

3.2 培养基

平板计数琼脂23.5g+脱脂奶粉1g，溶于1000mL水中。必要时用滤纸过滤。调节pH值为6.9±0.1。将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150mL。在121±1℃下灭菌15min，如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1℃。如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1℃。

注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。

4 仪器及玻璃器皿

微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：

4.1 培养箱，可以调节并保持到6.5±0.5℃

4.2 pH计，带温度补偿，精度为0.1

4.3 水浴，可以保持到46±1℃

4.4 三角瓶，250—300mL，带合适的塞子。

4.5 吸管，用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧。

4.6 培养皿，玻璃或塑料的，直径在90—100mm

5.操作步骤

5.1样品的稀释及培养

5.1.1 以无菌操作，将25mL样品注入含有225mL灭菌生理盐水的三角瓶内，充分混匀，制成1：10的稀释液。

5.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，充分混匀，制成1：100的稀释液。

5.1.3 另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支吸管。

5.1.4 根据对样品污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。

注：其他稀释方法可以使用，例如第一步稀释可以是10mL检测样品注入到90mL稀释液中，或11mL检测样品注入到99mL稀释液中。当样品和稀释液用量更大，方法的精密度和准确度就更高。

5.1.5稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的培养基（可放置于46±1℃水浴保温）注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将培养基倾入空的灭菌平皿内作空白对照。

注：从稀释样品到倾倒培养基，整个操作过程不应超过15min。

5.1.6 待培养基凝固，翻转平板，放入6.5℃培养箱内培养10天。

注：每叠皿不应超过6个，每叠皿之间以及与培养箱的壁之间应保持一定的间隙。

5.2 菌落计数方法

对平皿进行菌落计数时，应在柔和的光线下计数。为了便于计数，可使用适当的放大镜和（或）菌落计数器。以防极小的菌落遗漏，以及避免将平皿中杂质颗粒进行计数。仔细检查可疑的物质，如需要可使用更高倍数的放大镜，以区别菌落和外来物质。

5.3 菌落计数的报告

5.3.1 平板菌落数的选择

平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平板内若有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

5.3.2 稀释度的选择及报告

5.3.2.1 选取菌落数在10-300之间的培养皿作为计数的测定标准。

5.3.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数在10-300之间，则按下面的方法计数。

计算每mL牛奶中微生物的个数N，用以下的公式：

∑c

                 N = 

（n1+0.1n2）d

这里∑c： 是所有皿上菌落数的总和。

n1： 是第一个稀释度培养皿的个数。

n2： 是第二个稀释度培养皿的个数。

d： 是与第一个稀释液相对应的稀释因子

结果保留两位有效数字，后面的数字以四舍五入计算。当第三位数是5时，看其左边的数是奇偶数进行数字取舍；如28500进行数字取舍为28000，11500为12000。

结果以科学计数法表示。

举例

微生物计数给出以下的结果（包括两个带盖培养皿）：

在第一个稀释度（10E-2）：168和215个菌

在第二个稀释度（10E-3）：14和25个菌落

∑c 168+215+14+25 422

     N =  = = =19182

（n1+0.1n2）d [2+（0.1*2）]*10-2 0.022

根据上面所说结果进行取舍为19000，结果为1.9×104个/ml。

注：如果有两个以上可以计数的稀释度，公式应修改为用多个稀释度进行计算。如为三个稀释度，由下面的公式可计算出每毫升中微生物的数量。

∑c

                   N = 

（n1+0.1n2+0.01n3）d

5.3.2.3 如果菌落数均小于10，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数，报告每毫升牛奶菌落的估计数。

5.3.2.4 如果菌落数均超过300，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数，报告每毫升牛奶菌落的估计数。

方法二：快速法—21℃，培养25ｈ（IDF标准132A）

1 范围

本标准描述的是通过21℃时快速菌落计数技术进行嗜冷菌菌数估算的方法。

此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验—当需要很快的得到嗜冷菌估算值的时候。

2 方法提要

2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。

2.2 将培养皿在21℃条件下培养25h。

2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数，选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。

3 试剂

3.1 稀释液

生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液，灭菌。

3.2 培养基

平板计数琼脂23.5g+脱脂奶粉1g，溶于1000mL水中。必要时用滤纸过滤。调节pH值为6.9±0.1。将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150mL。在121±1℃下灭菌15min，如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1℃。如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1℃。

注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。

4 仪器及玻璃器皿

微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：

4.1 培养箱，可以调节并保持到21±1℃

4.2 pH计，带温度补偿，精度为0.1

4.3 水浴，可以保持到46±1℃

4.4 三角瓶，250—300mL，带合适的塞子。

4.5 吸管，用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧。

4.6培养皿，玻璃或塑料的，直径在90—100mm

5. 操作步骤

5.1样品的稀释及培养

稀释步骤同方法一中5.1.1—5.1.5。

5.1.6待培养基凝固翻转平板，放入21℃培养箱内培养25h。

注：每叠皿不应超过6个，每叠皿之间以及与培养箱的壁应保持一定的间隙。

5.2菌落计数方法

同方法一中5.2。 

5.3 菌落计数的报告

同方法一中5.3。

上一篇：食品中空肠弯曲菌的计数程序图

下一篇：食品接触面清洁程度的检验方法