一、实验目的和内容
目的：了解霉菌形态，掌握微生物载玻片湿室培养方法。
内容：1．霉菌载玻片湿室培养。
2．曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。
3．根霉假根的观察。
二、实验材料和用具
产黄青霉(Penicfillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopus nigrians)、总状毛霉(Mucor racemosus)等斜面菌种。
半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20%甘油;
透明胶带、剪刀、培养皿、载玻片、口形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、细口滴管、镊子、显微镜、接种环。
三、操作步骤
(一)霉菌的载玻片湿室培养
可4人合作，每人制作一霉菌的载玻片。
1．准备湿室   在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“冂”形载玻片搁架，在搁梁上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎，经12lC湿热灭菌30min后，置60℃烘箱中烘干，备用。
2．接种   用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。
3．加培养基   用无菌细口滴管吸取少量融化约60℃的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，其直径约为0.5cm(滴加量一般以l/2小滴为宜)。
4．加盖玻片   在培养基未彻底凝固前．用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压，使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁，否则不透气。
5．倒保湿剂   每皿倒大约3mL 20%的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润湿，以保持皿内湿度，皿盖上注明菌名、组别和接种日期。此为制成的载玻片湿室，置28℃恒温培养3～5d。
(二)黑根霉假根的培养
将融化的PDA培养基，冷却至50℃倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的l/2。冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在平板表面划线接种。然后将平皿倒置，在皿盖内放一无菌载玻片，于28℃培养2～3d后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构（图13—1）。
(三)镜检观察
1．湿室培养霉菌镜检载玻片   从培养16～20h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。绘图。
2．粘片观察   取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。
3．假根观察   将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。
4．制成永久装片   把观察到霉菌形态较清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。
四、注意事项
载玻片湿室培养时，盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此有极小缝隙，一是为了通气；二是使各部分结构平行排列，易于观察。
五、实验报告
(一)绘制镜检形态图
1．毛霉和根霉形态图，示各部。
2．青霉和曲霉形态图，示各部
（二）载玻片观察记录
各菌种的载玻片标本观察结果：
菌种 菌丝体
（气生菌丝、营养菌丝的粗细、色泽、菌丝有隔或无隔等） 无性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子着生特征等） 其他特征结构
（有无假根、足细胞匍匐菌丝、囊轴等）
       
六、问题和思考
1．什么叫载玻片湿室培养?它适用于观察怎样的微生物，有何优点?
2．湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂?
3．本实验中观察假根的设计原理是什么?此设计还适合于培养哪类菌。
 
   

 

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