一、实验目的和内容
目的：辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态；学习放线菌的观察方法。
内容：用水封计法、玻璃纸法、印片法观察放线菌的形态特征。
二、实验材料和用具
  细黄链霉菌(streptomycs micuoflavus)又称5406的培养平皿，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的玻璃纸培养平皿。
0.1%美蓝染色液、石炭酸复红染色液；
盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。
三、操作步骤
(一)观察自然生长状态的放线菌
用镊子小心取出用插片法培养的5406菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。
(二)水封片观察
取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍镜观察其单个分生孢子及其基内菌丝，并绘图。
(三)玻璃纸法的镜检观察
l．直接玻璃纸观察   分别用5406和棘孢小单孢菌的玻璃纸制片观察。制片时，于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片小心剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上。在玻璃纸与载玻片间不能有气泡，以免影响观察。将制片于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况，再用高倍镜仔细观察。注意区分5406菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝。观察棘孢小单孢菌时注意把视野调暗，其基内菌丝纤细发亮，其单个分生孢子发暗，直接生长在基内菌丝长出的小梗上。绘图。
2．印片染色法观察   用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用这微热载玻片盖在长有5406或棘孢小单孢菌的平皿上，轻轻压一下，注意将载玻片垂直放下和取出，以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然形态。反转有印痕的载玻片微微加热固定．用石炭酸复红染色l min，水洗，晾干。用油镜观察。绘图。注意比较两种菌的形态特征有何不同。
四、注意事项
1．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。
2．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，
3．不同观察方法中严格按要求进行，注意菌体的上下位置。
五、实验报告
1．绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的放线菌形态。
2．试比较5406菌与棘孢小单孢菌特征的异同。
六、问题和思考
1．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?
2．用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物?为什么?
3．以玻璃纸覆盖法培养和观察放线菌有何优点?试用此法设计一个观察青霉菌形态的实验。
注：
(一)插片法和搭片法培养放线菌
1．插片法
(1)制平板、接种：用冷却至约50℃的高氏1号琼脂培养基倒平板(每皿约20mL)，可用两种方法接菌：1、先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培养基的一半面积作来回划线接种(接种量可适当加大)；2、先插片后接种：用平板培养基的另一半面积进行。
(2)插片及培养：用无菌镊子取无菌盖玻片，在已接种平板上以45°角斜插入培养基内，插人深度约占盖玻片1/2长度(图11-1A)。同时，在另一半未经接种的部位以同样方式插入数块盖玻片，然后接种少量5406菌孢子至盖玻片一侧的基部，且仅接种于其中央位置约占盖玻片长度的一半左右，以免菌丝蔓延至盖玻片的另一侧。将插片平板倒置于28℃，培养3～7d。
2．搭片法
 (1)开槽及接种：用无菌打孔器在凝固后的平板培养基上打洞数个，并将棘孢小单孢菌孢子划线接种至洞内边缘。
(2)搭片及培养：在接种后的洞面上放一无菌盖玻片，平板倒置于28℃，培养3～7d（图11—1B）。
(二)玻璃纸法固体培养5406菌和棘孢小单孢菌
1．玻璃纸灭菌   将玻璃纸剪成比培养皿直径略小的片状，将滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片并稍润湿，然后把 滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。
2．制平板及铺玻璃纸   取冷凝后的高氏1号琼脂培养基，用无菌镊子将预先灭菌的块状玻璃纸平铺至平板培养表面，铺玻璃纸时可用无菌涂布器将玻璃纸与培养基之间的气泡除去。
3．涂布菌液及培养 取0.l mL的孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的平板培养基表面。接种平板倒置于28℃，培养 5～7d。
    
   

 

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