标本涂片、革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计标本中大致的含菌量，可用“少量”， “+ ”、“ ++ ”、“ +++”、“++++ ”表示。镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也能为鉴定厌氧菌提供参考和依据。如脆弱拟杆菌菌体细长，两端尖;韦荣球菌是极小的革兰阴性球菌。厌氧菌芽胞的位置、形态、大小对鉴定很有意义，必要时作芽胞形成试验。
二、标本接种
一般标本接种3 个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5 %~ lO % CO2 的环境中培养。如果只要求检出厌氧菌，只需接种l 个厌氧血琼脂平板，也可增加1 个相应的选择厌氧血琼脂平板。为便于在混合培养中及早发现厌氧菌，一般将标本分3 段划线接种，在第1 和第2 段交界处贴1 张甲硝哗(5 mg/片)纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有厌氧菌生长。
不同厌氧菌的生长速度和菌落形态各异，色素也有不同，荧光产生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类。
1.革兰阴性杆菌
(1)在BBE 琼脂平板上有灰黑色、直径 >lmm 的菌落，菌落周围有黑色的晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。
(2) 在卡那万古溶血琼脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德灯照射有砖红色荧光者，为产黑素普雷沃菌。
(3)菌落沉入琼脂内，使培养基表面留有小坑者，可能是解脲拟杆菌和纤细拟杆菌。
(4)菌落表面有小斑点，或如面包屑，结合涂片所见，可初步鉴定为具核梭杆菌。
2. 革兰阴性球茵菌体很小，排列成双、短链或小堆，菌落小，不透明，可能是小韦荣球菌。
3. 革兰阳性球菌排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。
4. 苹兰阳性无芽月色杆菌
(1)菌落呈臼齿形、粗糙，结核腋样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。
(2)菌体呈X 、Y 、V 排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。
5. 苹兰阳性芽胞杆菌只要见有芽胞，即可鉴定为梭菌属。菌落有双环溶血，卵黄平皿上卵磷脂酶试验和Nagler 试验阳性，涂片染色为革兰阳性短粗杆菌，有芽胞，有英膜，可鉴定为产气荚膜梭菌。
三、耐氧试验
当厌氧平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。从每个琼脂平板上挑取4~5 个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2 块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板(每个琼脂平板可划4~6 区，每区种一个可疑菌落) ，然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。
凡在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性厌氧菌(图3 - 48 中A 区) ;在需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌(图3 - 48 中B 区) ;在需氧和二氧化碳环境中生长，而在厌氧环境中不生长者为专性需氧菌(图3 - 48 中C 区) ;在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好的细菌为需二氧化碳菌(图3 - 48 中D 区) 。 
四、鉴定试验
可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等检查。
生化试验主要包括多种糖类发酵试验、呵|喋试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验， 4 h 即可观察结果;自动微生物鉴定系统，如VITEK-ANI 、MicroScan- ANI 等也可鉴定厌氧细菌。
在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下列事项: ①厌氧菌标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝(厌氧菌暴露于空气中时间太长可死亡) ，务必在30 min 内完成，同时应避免正常菌群的污染。②培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不利于厌氧菌生长。③ 若菌落太小，需用放大镜观察菌落。④作耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4 ~ 5 个性状不同的菌落，分别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。⑤ 如作胞外酶鉴定， 一定要有足够的菌液浓度。
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