这种方法适用于对不宜加热的液体和溶液的灭菌。过滤除菌的成分可以采用无菌操作加入到其他已经加热灭菌的成分中。过滤除菌还可用于过滤需要滤菌的空气，例如发酵用的无菌空气,尽管这种方法很难完全过滤空气中的噬菌体。膜滤器在过滤除菌时使用最广泛。
膜滤器通常是由高效的多孔醋酸纤维素膜组成，因其孔隙率不同有广泛的用途。与深度的过滤器相比，膜滤器是将比一定孔径大的粒子留在其表间，因为膜上最大的孔径要
比最小的残留粒子小。截留的粒子只与膜孔径的大小有关而不受静电吸引或吸附作用的
影响，所以生产厂给定的滤膜孔径是影响过滤的惟一因素。膜孔径的大小可以在一定范
围内有所变化，但生产厂必须提供准确的误差范围。例如，过滤细菌最常用的滤膜孔径为〔0.22 ±0.02)μm，这种滤膜可以用在具有较高相对压差的正压滤菌器中，在短时间内完成过滤，而且不影响灭菌的效果。
尽管不同的滤膜生产厂家生产了各种不同级别的小孔滤膜，但对于细菌培养基等的
灭菌，所有过程的最后一步都应用孔径为0.22μm的滤膜除菌。用于细菌计数分离以及真菌学样品分析的0.45μm的滤膜不能够满足细菌学无菌的要求。
过滤可分为负压过滤(如抽滤)和正压过滤。在样品的微生物分析中，经常会用到负
压过滤法。但培养基、糖溶液、血清等的过滤除菌，最好采用正压方式，主要有以下两个原因：一是采用负压滤菌需要一个带侧嘴的接收容器（如滤瓶），用以安装吸管或者使用过滤附件。对于前者来说灭菌的液体要采用无菌操作再次转移到最后的灭菌容器中，支路的滤器附件可使滤液直接滤入最后的灭菌荇器中，伹必须采取足够的保护措施防止从真空装盘倒吸的水、油和非无菌空气，或由于容器密封不严造成的非无菌空气的逬人。其中最后一点很难做到。采用负压的第二个缺点朵最大绝对压差是一个大气压(不可能达到)而采用正压滤菌时，可使用更高的压力，从而使过滤速度更快。
正压滤菌的膜滤器装置有着十分广泛的用途。在许多细菌学和真菌学分析实验室，
滤膜过滤被用于对碳水化合物溶液、乙醇溶液、酵母抽提液溶液和血清等溶液的灭菌，这些溶液需要量都较小，每批最多用100ml在小型微生物分析实验室，一种最常用的过滤装置是可以使用直径为13mm、25mm、47ml三种型号滤菌膜的Swinnex过滤架（Milli-pore滤器公司生产）:这种支架能连接具有Luer氏注射器接头的注射器。它能过滤1ml,10ml,100ml贵重的培养基添加液和稀有培养基而不造成任何浪费。它对生产线的培养基和空气的过滤灭菌(如在发酵过程中过滤灭菌)也十分有效。
碳水化合物(多糖除外)溶液、乙醇、盐溶液、维生素溶液和水在过滤前全部用有或没有〔最好有〗一次性玻璃纤维的预过滤垫过滤。含蛋白的培养基和一些其他液体在采用玻璃纤维预过滤后再用双层膜过滤十分容易，最后的过滤程度取决于预过滤的程度[如MilliporeDA的孔径为(0.65±0.03)μm]。血清和原生质等液体可以采用逐步减小的滤膜孔径进行过滤。例如先用玻璃纤维预过滤，然后再分别采用孔径为12μm、0.65μm、0.45μm的滤膜过滤，最后使用孔径为0.22μm的滤膜过滤。滤膜非常薄，所以可以将所需孔径的滤膜同时放到滤膜架上。在两张滤膜之间放人涤纶网，这样可以提高流动速率。使用前，将滤膜和滤膜架一起在高压锅中灭菌。
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