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溶源性细菌的检查与鉴定



录入时间:2015-3-9 10:37:35 来源:青岛银河澳门官网入口

      原理

细菌染色体上整合有前噬菌体(或称原噬菌体)并能正常生繁殖而不被裂解的细
,称为溶源细菌。溶源性细菌在然界中普遍存在,而且自发裂解,释放温和噬菌
体,
但频率较低(10-2~105)物理方法(如紫外线和高温)和化学方法(如丝裂霉素C)可诱导大部分溶源裂解并释放温和噬菌体。溶源性细菌对同种或关系密的噬菌
有免疫性,因此对溶源菌的检查必须相应的敏感菌株才能确定,敏感菌株对以从待检的溶源菌相近的种或变种或不菌株中找到。

溶源性细菌裂解释放噬体,会给发酵工业带来威胁,溶源性细使宿主细胞发生溶源转变,不仅可以保护溶源免受同噬菌体的感染,还会赋予宿主细胞新的特性,温和噬菌体被广泛用转导、基因工程载体和分生物学等领域。实验采用诱导方法使溶源细裂解.再用敏感菌双层平板法检测诱导后噬菌体释放数目的增加,从而确认细的溶源性。

材料

1. 待检菌——大肠杆225 (λ),敏感菌——大肠杆菌226。
2
.基及药品和试剂 LB固体、半体和液体培养基,1%蛋白胨,100mmol/l Tris-HCL(pH7.6)缓冲液或生理盐水,仿,0.2%柠檬酸钠溶液。
3、设备 水浴、台式离心机、紫外光灯、摇床等。
4、器皿及其他 试管、培养皿、角瓶、吸管,离心管、滤膜、滤膜滤器等。

方法与步骤

实验采用紫外线处理诱导溶源菌裂解,未经诱导处理的溶源菌菌悬液做对照。
1.溶源菌培养 将经LB斜面活化的大肠菌225λ),接种装有20mlLB培养液的250ml角瓶内,30振荡培养16h,从中取2ml菌悬液接另装有20ml LB培养液的250ml角瓶内,37振荡培养2h至对数期。

2排除游离噬菌体 如待检菌株为芽孢杆菌,可先制成孢悬液,经80℃ 10min处理,杀死溶源菌表面可能吸附的及游        离的噬菌体;如待检菌抹为非芽孢杆菌,利用噬菌体制备的抗血清或0.2%柠檬酸钠溶液洗涤对数期溶源菌细胞,除去表面吸附的及游离的噬菌体。然后经4000r/min离心10min,清液加人敏感指示菌做双层平板测定,用于检验样品屮足孖钌游离的噬菌体及吸附「溶源菌表曲的噬体,离心的菌体细胞进行诱导处理。

3.诱导溶源 离心后收体用无菌生理盐水洗涤两次,用生盐水或100mmol/l Tris-HCL缓冲液(pH7.0制成终浓度为1011个/ml细胞的菌悬液,每加5ml菌悬液,经紫外灯30W,距离30cm、照射30s,即加入5ml双倍浓度的LB液,混匀后37黑暗2h。

4,溶源性株检查 按双琼脂法操作,取上述诱导裂解液加入仿,以10倍稀释法适当稀释,选择后3个稀释度的稀释液,毎个稀释液取0.3ml与0.2ml对数期敏感大肠杆菌226悬液混匀,再融化后冷却至45℃的LB半体培养基,立即混匀,随即倾入LB固体培养平板上,凝固后,37培养6h观察。经过培的平板如量噬菌斑出现就证明被检菌株是溶源菌。

 

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