一、实验目的和内容
目的：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。
内容：
l．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线方法分离微生物。
3．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、实验材料和用具
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通变形菌(Proteus vulgaris)斜面菌种。
已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水(带玻璃珠)1瓶，4.5mL无菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。
无菌培养皿12套，1mL无菌移液管10支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。
三、操作步骤
(一)土壤稀释分离
1．取土壤 取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2．制备稀释液(要无菌操作)
(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
(2)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液(图3-1)。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。
3. 混菌法测定菌落数的方法
(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作，见图3-2。
图3—2 倒平板的方法
（2）放线菌：取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5～6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。
（3）霉菌：取10-2、10-3两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。在融化的土豆蔗糖培养基中，每100mL加入灭菌的乳酸1mL，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。
4．培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28～30℃中恒温培养，细菌培养1～2d，放线菌培养5～7d，霉菌培养3～5d。观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。
（二）平板制作及划线分离方法。
1．倒平板 按无菌操作要求，在火焰旁操作（图3—2），做法如3（1）。
2．划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见图3—3。
（三）斜面接种和穿刺接种
1．斜面接种
（1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。
（2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部（图3—4A）。注意划线要轻，不可把培养基划破。
（3）接种后30℃ 恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。
2．穿刺接种
（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名）、接种日期，接种人等）。
（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。
（3）接种后30℃恒温培养， 24h后观察，比较两种菌的生长结果。
四、注意事项
1．一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。
2．在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。
3．放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。
五、实验报告
1．记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。
计算方法：选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数，按以下公式：
总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数
2．分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。
3．比较两种细菌穿刺接种的结果，并进行分析。
七、问题和思考
1．在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法?
2．试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。
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