高压蒸气灭菌
（一）目的要求
1．了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。
2．学习高压蒸气灭菌的操作方法。
（二）基本原理
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表2—1），二是湿热的穿透力比干热大（表2—2），三是湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
表2—1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
卵白蛋白含水量/% 30分钟内凝固所需温度/℃
50 56
25 74～80
18 80～90
6 145
0 160～170
在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表2—3）
表2-2 干热温热穿透力及灭菌效果比较
温度/℃ 时间/h 透过布层的温度/℃ 灭菌
20层 10层 100层
干热130-140 4 86 72 70.5 不完全
湿热105.3 3 101 101 101 完全
表2—3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系
压力数 全部空气排出时的温度/℃ 2/3空气排出时的温度/℃ 1/2空气排出时的温度/℃ 1/3空气排出时的温度/℃ 空气全不排出时的温度/℃
Mpa Kg/cm2 Ib/in2
0.03 0.35 5 108.8 100 94 90 72
0.07 0.70 10 115.6 109 105 100 90
0.10 10.5 15 121.3 115 112 109 100
0.14 1.40 20 126.2 121 118 115 109
0.17 1.75 25 130.0 126 124 121 115
0.21 2.10 30 134.6 130 128 126 121
现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.
一般培养基用0.1Mpa（相当于15 Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6℃灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa,121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30min。
实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图2-2，A）和手提式（图2—2，B）二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。
（三）器材
牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿(6套一包)，手提式高压蒸气灭菌锅等。
（四）操作步骤
1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
（五）实验报告
l．结果
检查培养基灭菌是否彻底。
2．思考题
（1）高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？
（2）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素?
（3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?
（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?为什么?
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