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蜡样芽胞杆菌MPN计数法(GB4789.14-2014)



录入时间:2014-12-24 11:40:28 来源:银河澳门官网入口

流程

4.2操作步骤

4.2.1样品处理

冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2 ℃~5 ℃不超过18 h解冻,若不能及时检验,应放于-10℃~ -20℃保存;非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于2 ℃~5 ℃冰箱保存,24 h内检验。

4.2.2样品制备

称取样品25 g,放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内,用旋转刀片式均质器以8000 r/min~10000 r/min均质1 min~2 min,或放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min。若样品为液态,吸取25 mL 样品至盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀,作为1:10的样品匀液。

4.2.3样品的稀释

吸取4.2.2中1:10的样品匀液1 mL加到装有9mL PBS或生理盐水的稀释管中,充分混匀制成1:100的样品匀液。跟据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。

4.2.4样品接种

根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别移入三块MYP琼脂平板,然后用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如MYP琼脂平板表面有水珠,可放在25 ℃~50 ℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。

4.2.5分离、培养

4.2.5.1 分离

在通常情况下,涂布后,将平板静置10 min。如样液不易吸收,可将平板放在培养箱30 ℃±1℃培养1 h,等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。如果菌落不典型,可继续培养24 h±2 h再观察。在MYP琼脂平板上,典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇),周围有白色至淡粉红色沉淀环(表示产卵磷脂酶)。

4.2.5.2纯培养

从每个平板(符合4.4.1.1要求的平板)中挑取至少5个典型菌落(小于5个全选),分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养,30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,进行确证实验。在营养琼脂平板上,典型菌落为灰白色,偶有黄绿色,不透明,表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状,边缘常呈扩展状,直径为4 mm~10 mm。

4.3确定鉴定

4.3.1染色镜检

挑取纯培养的单个菌落,革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌,大小为(1μm~1.3μm)×(3μm~5μm),芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不膨大于菌体,菌体两端较平整,多呈短链或长链状排列。

4.3.2生化鉴定

4.3.2.1 概述

挑取纯培养的单个菌落,进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。蜡样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别见表1。

 

 

4.3.2.2动力试验

用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30℃培养24h。有动力的蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。也可用悬滴法检查。

4.3.2.3溶血试验

挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB琼脂平板上,30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色,不透明,似白色毛玻璃状,有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象,而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血,巨大芽胞杆菌为不溶血。

4.3.2.4根状生长试验

挑取单个可疑菌落按间隔2cm~3cm左右距离划平行直线于经室温干燥1d~2d的营养琼脂平板上,30 ℃±1 ℃培养24 h~48h,不能超过72h。用蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌标准株作为对照进行同步试验。蕈状芽胞杆菌呈根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征。

4.3.2.5溶菌酶耐性试验

用接种环取纯菌悬液一环,接种于溶菌酶肉汤中,36 ℃±1 ℃培养24 h。蜡样芽胞杆菌在本培养基(含0.001%溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。巨大芽胞杆菌不生长。

4.3.2.6蛋白质毒素结晶试验

挑取纯培养的单个可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上,30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,并于室温放置3 d~4 d,挑取培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥,微火固定后,加甲醇作用30 s后倾去,再通过火焰干燥,于载玻片上滴满0.5%碱性复红,放火焰上加热(微见蒸气,勿使染液沸腾)持续1 min~2 min,移去火焰,再更换染色液再次加温染色30 s,倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。观察有无游离芽胞(浅红色)和染成深红色的菱形蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成的不丰富,应再将培养物置室温2 d~3 d后进行检查。除苏云金芽胞杆菌外,其他芽胞杆菌不产生蛋白结晶体。

4.3.3生化分型(选做项目)

根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液化试验,将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别,见表2。

样品接种

取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉汤中,每一稀释度接种3管,每管接种1 mL(如果接种量需要超过1 mL,则用双料胰酪胨大豆多黏菌素肉汤)。于30 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。

5.2.5培养

用接种环从各管中分别移取1环,划线接种到MYP琼脂平板上,30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。如果菌落不典型,可继续培养24 h±2 h再观察。

5.2.6确定鉴定

从每个平板选取5个典型菌落(小于5个全选),划线接种于营养琼脂平板做纯培养,30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,进行确证实验,见4.3。

5.3结果与报告

根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性的试管管数,查MPN检索表(见附录B),报告每g(mL)样品中蜡样芽胞杆菌的最可能数,以MPN/g(mL)表示。


 

 

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