检测TSAye平板上的典型菌落形态，用斜射光观察是非常有帮助，但不是必须的。
从30℃或低于30℃培养的平板上挑取生长良好的典型菌落，涂于洁净载玻片上，用0.85%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片于相差显微镜的油镜下观察。李斯特氏菌为短杆状，有轻微的旋转和翻滚运动。而大的杆状，或快速运动的杆状细菌则不是李斯特氏菌。应用阳性的李斯特氏菌做对照。
过氧化氢酶试验：李斯特氏菌阳性反应。
革兰氏染色试验：将培养16-24小时的培养物进行染色。李斯特氏菌呈短杆状阳性菌。但若培养时间过长，染色会发生变化。细胞呈现Coccoidal菌现象。着色轻的部位呈现栅栏状，被当作类白喉菌排除掉。
挑取典型菌落接种到TSBye培养基(进行糖发酵试验)和其它检测培养基上，35℃培养24小时，这些培养物可置于4℃冰箱中保存数天，以重复利用。商业化的试剂盒也可于分离鉴定(见E-11)。
溶血试验：将7%羊血琼脂平板底面划分为20-25个小格，从TSAye上挑取菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，于35℃培养24-48小时，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。
于明亮处观察洁净的血琼脂平板，单增李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，绵羊李斯特氏菌产生大的透明溶血环。注意：不要据此来区别李斯特氏各种菌，仅仅是一种溶血现象。用CAMP试验来确证李斯特氏各种菌。(注意：当血平板的厚度比通常的5mm更薄时，非常容易观察到溶血环，另外这可以通过覆盖一层血琼脂1-2mm来实现)。
硝酸盐还原试验：这个试验是非必需的。只有默氏李斯特氏菌能降解硝酸盐，从而区别开格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用TSBye肉汤培养物接种到硝酸盐肉汤中，35℃培养5天，加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂B，混匀，如出现紫红色，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜色变化，则加入少量锌粉，放置1小时，如出现红色，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。也可按以下过程进行检测:加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂C，混匀，如出现桔红色，则表明降解了硝酸盐，存在亚硝酸盐。如无颜色变化，则加入少量锌粉，放置1小时，如出现桔红色，表明仍有硝酸盐存在，未被细菌降解。
动力试验：由TSBye肉汤培养物接种到SIM培养基或MTM培养基， 室温培养7天，逐日观察，李斯特氏菌有动力，呈伞状生长。MTM培养基上形状尤为突出，可以明显观察到伞形。另外，通过相差显微镜，可以观察30℃ TSBye培养基上的培养物的翻滚运动。
将TSBye上培养物接种于含以下0.5%糖的紫色肉汤中(可加入小倒管)：葡萄糖、七叶苷、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培养7天。阳性反应是产酸不产气。不同菌种的生化反应见表1。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖都是阳性反应。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外的李斯特氏菌对甘露醇呈阴性反应。若OXA、PALCAM、MOX或LPM(加七叶苷和三价铁)的纯化物着色是确定的，则七叶苷发酵实验可省略
CAMP试验：当溶血试验结果不确定时，可用CAMP实验来区别李斯特氏菌的各个种。在羊血琼脂平板上划两条平行线，两条线上分别接种β型溶血金黄色葡萄球菌与马红球菌培养物。在该两线之间，垂直划线，接种待测培养物，与两线相近但不相交，于35℃培养24-48小时后，观察溶血情况。单增李斯特氏菌与西尔李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌接种点附近的溶血增强，其它李斯特氏菌不溶血。单增李斯特氏菌在24小时溶血现象比在48小时更明显。为使马红球菌能长出一条很好的划线，需要将斜面培养物培养48小时，而不是24小时。同时，羊血琼脂平板需新鲜配制。
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