取庖肉培养基3支，煮沸10～15min，做如下处理：

第一支：急速冷却，接种检样均质液1～2mL ；

第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温 10min， 急速冷却；

第三支：接种检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。

 　以上接种物于30℃培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同6.1，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。

分离培养

选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物(必要时可重复一次适宜的加热处理)接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍珠层样)薄层，但G型菌无此现象。根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30℃培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。

培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成2份，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48h，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特征的菌落，而在需氧条件下则不生长。

注：

        为检出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜检样需预温37℃(流质蜂蜜)，或52～53℃(晶质蜂蜜)，充分搅拌后立即称取20g，溶于100mL灭菌蒸馏水(37℃或52～53℃)，搅拌稀释，以8000～10000r/min离心30min(20℃)，沉淀，加灭菌蒸馏水1mL，充分摇匀，等分各半，接种庖肉培养基(8～10mL)各1支，分别在30℃及37℃下厌氧培养7天，按6.2进行肉毒毒素检测。

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