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微生物限度检查法——检查法



录入时间:2008-10-20 11:51:53 来源:青岛海博 

   
   (2) 沙门氏菌(Salmonella species)  取营养肉汤培养基3份,每份各100ml,2份分
别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作阳性对照,第3份加入与供试液等量的
稀释剂作空白对照。培养18~24小时,空白对照应无菌生长。取其余2份培养液各1ml,
分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中,培养18~24小时。分别划线接种于胆盐硫乳
琼脂(或沙门氏、志贺氏菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基
的平板上,培养18~24小时或延至40~48小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时,供
试品的平板无菌落生长,或有菌落但不同于表2所列特征时,可判为未检出沙门氏菌。
    如供试品平板生长的菌落特征有与表2所列菌落形态特征相符或疑似者,均应挑选2
~3个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养斜面上,阳性对照同时接种,培养18~24小时后,
阳性对照的斜面应为红色,底层为黄色,硫化氢阳性,而供试品疑似菌斜面未见红色、
底层未见黄色,可判为未检出沙门氏菌。否则,应继续做革兰氏染色、生化试验、动力
检查与血清凝集试验。
             表2   沙门氏菌菌落形态特征
───────┬────────────────────────────
  培 养 基  │                   菌  落  形  态
───────┼────────────────────────────
胆盐硫乳琼脂 │无色至浅橙色,半透明,菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。
───────┼────────────────────────────
沙门氏、志贺 │无色至淡红色,半透明或不透明,菌落中心有时带黑褐色。
氏菌属琼脂   │
───────┼────────────────────────────
曙红亚甲蓝琼脂│无色至浅橙色,透明或半透明,光滑湿润的圆形菌落。
───────┼────────────────────────────
麦康凯琼脂   │无色至浅橙色,透明或半透明,菌落中心有时为暗色。
───────┴────────────────────────────
    革兰氏染色  照大肠杆菌项下方法操作,镜检。
    靛基质试验  照大肠杆菌项下操作并判断结果。
    尿素酶试验  取疑似菌斜面培养物接种于尿素琼脂培养基斜面上,培养24小时,斜
面变为红色为阳性,不变色为阴性。
    氰化钾试验   取培养20~24小时的疑似菌株营养肉汤培养液,分别用白金耳沾取1
环,接种至对照培养基及氰化钾培养基内,立即以橡胶塞塞紧,培养24~48小时,对照
管应有菌生长,试验管有菌生长者为阳性,无菌生长为阴性。
    赖氨酸脱羧酶试验  取疑似菌斜面培养物分别接种赖氨酸脱羧酶培养基及对照培养
基上。培养24~48小时,对照管应为黄色,试验管呈紫色为阳性,呈黄色为阴性。
    动力检查  取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基管中,培养24小
时,细菌沿穿刺线外周扩散生长,为动力阳性,否则为阴性。阴性培养物,应在室温保
留2~3天后,再判断。
    血清凝集试验  在洁净载玻片一端,以白金耳沾取沙门氏菌属A~F“0” 多价血清
2~3环,再取斜面上部的培养物少许,与血清混合,将玻片前后侧动,如出现凝集现象,
应以0.9%氯化钠溶液与同株培养物作对照试验,无凝集现象时判为血清凝集阳性。时有
反应迟缓,需将玻片与湿棉球置平皿内,约过20分钟,再观察。仍未出现凝集时,应取
斜面培养物,置含少量0.9%氯化钠溶液的试管中,制成浓菌悬液,在100℃水浴中保温
30分钟,待冷,再作凝集试验。如出现凝集,应判为阳性,否则为阴性。
   上述各项试验反应,一般应为硫化氢阳性(或阴性),靛基质阴性,尿素酶阴性,氰
化钾阴性,赖氨酸脱羧酶阳性,动力检查阳性,A~F“0” 多价血清凝集试验阳性。各
鉴定结果按表3判定。                          
               表3   沙门氏菌检查结果判定
──┬─────────────────┬────┬─────────
  序│               血清凝集试验       │        │
    │             (A~F“0” 血清)     │        │
    ├──┬───────┬──────┤生化试验│    结  果
    │凝集│  100℃30分钟 │0.9%氯化钠 │        │
  号│反应│    凝集反应  │溶液对照    │        │
──┼──┼───────┼──────┼────┼─────────
  1 │阳性│   阳  性     │  阴  性    │  符  合│检出沙门氏菌
  2 │阴性│   阳  性     │  阴  性    │  符  合│检出沙门氏菌
  3 │阴性│   阴  性     │            │  不符合│未检出沙门氏菌
──┴──┴───────┴──────┴────┴─────────
   上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物,均应进一步鉴定后作出结论。
    (3) 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)  取胆盐乳糖培养基3份,每份各100ml,
2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作为阳性对照,第3份加入与供试液
等量的稀释剂作空白对照。培养18~24小时,空白对照应无菌生长,其余2份培养液划线
接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基平板上,培养18~24小时。当阳性对照的平板呈
现阳性菌落时,供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长,可判为未检出绿脓杆菌。
    绿脓杆菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散,表面湿润,灰白色,周围时有蓝绿
色素扩散。如生长菌落具有上述特征或疑似者,应挑选2~3个菌落,分别接种营养琼脂
培养基斜面上,培养18~24小时,取培养物革兰氏染色,并作氧化酶试验。
    氧化酶试验  取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养
物涂于滤纸片上,再滴加新配制的1%二甲基对苯二胺盐酸盐试液,在30秒内呈粉红色逐
渐变为紫红色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。
    如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均可判为未检出绿脓杆菌。
否则,应进行绿脓菌素试验。
    绿脓菌素(Pyocyanin) 试验  取上述琼脂斜面培养物,接种于绿脓菌素测定用培养
基斜面上,培养24小时后,在试管内加氯仿3~5ml,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,
将氯仿移至另一试管中,加入1mol/L盐酸溶液约1ml,振摇后,静置片刻,如在盐酸溶液
层内出现粉红色,即为绿脓菌素阳性。试验同时应有空白对照试验。
    当空白对照试验呈阴性时,供试品检查为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓
菌素阳性、可判定为检出绿脓杆菌。
    绿脓菌素阴性的培养物,应继续以下试验。
    硝酸盐还原产气试验  取营养琼脂培养基斜面培养物,接种于硝酸盐胨水培养基中,
培养24小时,如在培养基的杜氏管中有气体产生,即为阳性。
    42℃生长试验 营养琼脂培养基斜面培养物于0.9%无菌氯化钠溶液中,制成菌悬液,
再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面上,立即置41±1℃水浴中培养24~48小时,有菌
苔生长者为阳性;否则为阴性。
    明胶液化试验  以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物,穿刺于明胶培养基内,
培养24小时,取出置冰箱内10~30分钟。如培养基仍呈溶液状,为阳性。
    当革兰氏阴性杆菌,氧化酶试验阳性,绿脓菌素试验为阴性,其硝酸盐还原产气试
验、42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时,应判为检查绿脓杆菌。
    (4) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)   取亚碲酸钠肉汤(或营养肉汤)
培养基3份,每份各100ml,2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作为阳
性对照,第3份加入与供试液等量的稀释剂作为空白对照。均培养18~24小时(必要时可
延至48小时)。空白对照应无菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基
平板上或甘露醇高盐琼脂培养基平板上,培养24~72小时。当阳性对照的平板呈现阳性
菌落时,供试品的平板如无菌落生长,或有菌落但不同于表4所列特征,可判为未检出金
黄色葡萄球菌。
          表4  金黄色葡萄球菌菌落形态特征
─────┬─────────────────
  培养基  │      菌     落    形     态      
─────┼─────────────────
卵黄高盐  │金黄色、圆形凸起,边缘整齐,外围有
琼脂      │卵磷脂分解的乳浊圈,菌落直径1~2mm
─────┼─────────────────
甘露醇高盐│金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有
琼脂      │黄色环,菌落直径约0.7~1mm        
─────┴─────────────────
    如有菌落生长并与表4所列特征相符或疑似时,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养
琼脂培养基斜面上,培养18~24小时,取其培养物革兰氏染色,并作血浆凝固酶试验。
    血浆凝固酶试验  取灭菌小试管3支,各加入血浆①-无菌水(1:1)0.5ml,1支加入
被检菌株的营养肉汤培养液(或浓菌悬液)0.5ml,其余2支作对照管;1支加入金黄色葡
萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9%氯化钠
溶0.5ml作空白对照。将3管同时培养。3小时后开始检查,以后适当时间逐次观察直至24
小时。空白对照管的血浆流动自如,阳性对照管血浆凝固,试验管血浆凝固者为阳性;
阳性对照管和空白对照管任何一管不符合要求时,应另制备血浆,重新试验。
    当空白对照和阳性对照符合要求,供试品的菌株为革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试
验阳性,判定为检出金黄色葡萄球菌。
    结果判断
    细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规
定,应判供试品合格;其中任何一项不符合该品种项下规定,应判供试品不合格。
    细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时,
应从同一批号样品中随机抽样,复试两次,以三次结果平均值报告。
    眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告,须以二次复试结果均不得长菌,方可判
为供试品合格。
    如发现营养琼脂培养基平板生长霉菌(酵母菌)菌落数或虎红琼脂培养基平板上生
长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时,应判为供试品不合格。
    各类制剂检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再抽样复试,即应
判该供试品不合格。
    ①  血浆的制备  以无菌注射器吸取灭菌的含5%枸橼酸钠的0.9%氯化钠溶液1ml,
用无菌操作采取家兔(或羊、人)血9ml,轻轻混匀数分钟。待血液不凝固时,徐徐放入
灭菌离心管中,离心,分离血浆,用灭菌吸管取血浆移至灭菌试管中,置冰箱内备用。
临用前必须用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌测试,证明血浆合格后,方可
用于试验。

 

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