1 、细菌、霉菌与酵母菌计数
(1) 平皿菌落计数法 取均匀供试液,进一步稀释成1:10<2> 、1:10<3>等适宜的稀
释度。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃
的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度应作2～3个平皿。
细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用虎红琼脂培养基，酵母菌计数用酵母浸出
粉胨葡萄糖琼脂培养基，合剂用虎红琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。
菌数测定空白对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细
菌、霉菌计数用的培养基制备平板、培养、检查，不得长菌。
细菌培养时间为48小时,分别在24及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数为准。
霉菌、酵母培养时间为72小时，分别在48及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为
准。
营养琼脂平板一般点计细菌菌落数，虎红琼脂平板一般点计霉菌菌落数，在特殊情
况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡
萄糖琼脂平板仅点计酵母菌菌落数。液体制剂同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。含
蜂蜜及王浆的合剂的霉菌、酵母菌菌落数分别测定，合并计数。菌落如蔓延生长成片，
不宜计数。
点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30～300之间的稀释级,霉菌宜选取平均菌
落数在30～100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30～300(30～
100)之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30～300(30
～100)之间时，按下式计算两级比值。
高稀释级的平均菌落数×稀释倍数
比值＝────────────────
低稀释级的平均菌落数×稀释倍数
当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2时，以低稀释级平均菌落数乘以
稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30～300之间时,以后2个稀释级计
算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的稀
释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300(100)以上，按最高
稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释
级的菌落数乘以稀释倍数报告。如当1:10（或1:100 ）稀释级平均菌落数等于或大于原
液（或1:10稀释级）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。
(2) 培养基稀释法 取供试液（原液或1:10供试液）3份，每份各1ml,分别注入5个
平皿内（每皿各0.2ml）。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置
培养，计数。每1ml注入的5个平板点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数
据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时,则报告菌数为
小于10个。
2 、控制菌检查 除另有规定外，取供试液10ml(相当供试品1g、1ml 、10cm<2>),
直接或处理后接种，经增菌分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验与血清凝集试验项
检查。
(1) 大肠杆菌(Escherichia coli) 取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml,2份分别
加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀
释剂作空白对照。培养18～24小时（必要可延至48小时）。空白对照应无菌生长。其余
2份培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18～24小时。当阳性
对照的平板呈阳性菌落时,供试品的平板无菌落生长,或有菌落但不同于表1所列的特征,
可判为未检出大肠杆菌。
表 1 大肠杆菌菌落形态特征
───────┬──────────────────
培养基 │ 菌 落 形 态
───────┼──────────────────
曙红亚甲蓝琼脂│呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，
│菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆
│形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿
│润，常有金属光泽。
───────┼──────────────────
麦康凯琼脂 │鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色，
│圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
───────┴──────────────────
如生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者,应挑选2～3个菌落分别接种于营养琼脂
培养基斜面，培养18小时，作以下检查：
革兰氏染色 取上述斜面培养物，涂片，固定。以结晶紫染液染色1分钟,水洗，革
兰氏碘液媒染1分钟，水洗，滤纸吸干余水。以乙醇脱色20～30秒钟,水洗。滴加沙黄染
液复染1分钟，待干后镜检。
乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48小时，观察产
酸（培养基变色），产气（杜氏管内有气泡）。
靛基质试验 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养48±2小时,沿管
壁加入对靛基质试液0.3～0.5ml，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
甲基红试验 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48±2小
时，于每1ml培养液中加入甲基红指示剂1滴，立即观察，呈鲜红色或桔红色为阳性，呈
黄色为阴性。
乙酰甲基甲醇生成试验（V-P 试验） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨
水培养基，培养48±2小时，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇液1ml，混匀，再加40％
氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，出现红色为阳性。加试剂4小时内，如出现红色亦应判
为阳性，无红色反应为阴性。
枸橼酸盐利用试验 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，培养48
±2小时,培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变
时为阴性。
当空白对照试验呈阴性，供试品检查为革兰氏阴性无芽孢杆菌；乳糖发酵产酸产气
或产酸不产气；IMViC 试验为阳性、阳性、阴性、阴性或阴性、阳性、阴性、阴性，判
为检出大肠杆菌。对可疑反应的菌株，应重新分离培养后，再作生化试验证实。
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