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椰毒假单胞菌酵米面亚种检验



录入时间:2014-8-18 11:33:38 来源:银河澳门官网入口

1 增菌

用无菌操作取样品25g,加入有225mL的增菌液中(银耳取样品1g,加入有20mL的增菌液中)置于36±1℃恒温培养箱中培养48h。

2 平板分离

取增菌液1环,划线按种PDA平板, 36±1℃培养24~48h。

PDA平板:菌落1~2mm,灰白色或乳白色,光滑、湿润、边缘整齐。培养48h后,中心有凸起,呈草帽状,菌落周围有黄绿色素扩散到基质中。

卵黄琼脂平板:菌落表面光滑、湿润,48h后,菌落周围形成乳白色混浊环,斜射日光下可见环的表面呈虹彩现象。

SS琼脂平板:不生长或微弱生长。

3 纯化

从卵黄琼脂平板上挑取卵黄脂酶阳性,并带有虹彩环的单个菌落,接种PDA斜面, 36±1℃培养24h。

4 生化试验

从纯化培养的PDA斜面上挑取少量菌苔,分别接种于Hugh-Leifson培养基、蛋白胨水、缓冲蛋白胨水、西檬氏柠檬酸盐培养基、糖发酵管及苯丙氨酸培养基, 36±1℃培养,按单项试验要求分别进行观察。产毒培养

取已确证为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株接种PDA斜面,36±1℃,培养24h,加入3mL灭菌生理盐水,制成约100亿/mL的菌悬液,用无菌吸管吸取0.5mL,滴在铺好灭菌玻璃纸的半固体PDA平板上,用灭菌L形棒涂布均匀, 26±1℃,培养5d。取下带菌的玻璃纸,将半固体平板放入消毒锅内,100℃流动蒸汽灭菌30min。室 温冷却后,置-10~-20℃冰箱过液。将冰冻好的半固体平板置室 温融化,用灭菌吸取出冻融液,经滤纸过滤放灭菌试管或三角烧瓶中,4℃避光保存,此为粗毒素。

动物试验

 取粗毒素或经水浴蒸发的5~10倍浓缩液0.5mL,灌胃体重为18~20g的小白鼠3只,观察7天。若菌株产米酵菌酸,小白鼠在灌胃后20min~24h内发病、死亡。主要症状为竖毛,萎靡不振,继而躁动,行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐,呈角弓反张状,呼吸急促、死亡。

 


 

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