1）原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度。  在纸片周围可抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性。 

(2) 制备抗菌药物纸片  专用药敏纸片：用加样或浸泡的方法使每片的药量达到一定的规定量，冷冻干燥后密封，-20°C保存备用。 （3）配制培养基 
 水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）琼脂是对生长较快的需氧和兼性厌氧菌进行药敏试验的标准培养基，pH7.2-7.4，琼脂厚度为4mm。 
 对营养要求较高的细菌进行药敏试验时，应在MH琼脂中加入相应的营养添加剂。 （4）细菌接种 
 接种物的准备可采用生长法或直接菌落悬液法。 
 为使药敏试验的接种浓度标准化,应使用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，制备好的菌液应在15min内接种完毕。 
 置35℃孵育16-18h后读取结果，厌氧菌应孵育在含CO2的环境中，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h，以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。 （5） 结果解释和报告 
 用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径，参照NCCLS标准判断结果。常分为以下三级：敏感、中度敏感、低度敏感 （6）纸片法药敏结果的影响因素 
 培养基的质量对结果的准确性有直接影响，如pH、硬度、湿度和深度等；  药敏纸片的含药量是影响抑菌圈大小的重要因素；  接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一；  试验操作质量；培养条件和温度、时间；  抑菌圈测量工具的精确度； 
 质控菌株本身的药敏特性是否合格，有无变异。 （7）质量控制 
 采用标准菌株是进行药敏试验质量控制的主要措施。 
 常用的临床药敏质控标准菌株有：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠杆菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853 等。

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