进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法
1、 范围
本标准规定了进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法。
本标准适用于进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测。
2、 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括错误的内容）或修订修订版均不使用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本，凡是不住日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T4789.28—2003 食品微生物学检验 染色法、培养基和试剂
SN 0330—1994 出口食品中微生物学检验通则
3、 设备和材料
3.1 冰箱：4℃~~20℃
3.2 恒温培养箱：30℃±1℃、24℃±1℃、35℃±1℃
3.3 恒温水浴锅
3.4 均质器。
3.5 显微镜：10X~100X
3.6 离心机：4000r/min。精度0.1g。
3.8 VIDAS全自动免疫酶标分析仪。
注：VIDAS全自动免疫酶标分析仪是由法国梅里埃公司提供的产品的商品名，给出这一消息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可以使用这些等效产品。
3.9 高压灭菌锅。
3.10 解剖镜。
3.11 锥形瓶：100ml、500ml.
3.12 灭菌吸管：1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。
3.13 灭菌平皿：直径90mm。
3.14 灭菌试管：16mm×160mm
3.15 离心管：30mm×100mm
3.16 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。
3.17 绵羊李斯特氏菌标准株。
3.18 英诺克李斯特氏菌标准株。
3.19 西尔李斯特氏菌标准株。
4、培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
4.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE）：见第A.1章。
SN/T 0184.1—2005
4.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE）：见第A.2章。
4.3 Fraser肉汤增菌液（FB1，FB2）见第A.3章。
4.4 PALCAM琼脂：见第A.4章。
4.5 OXA琼脂：见第A.5章。
4.6 7%羊血琼脂：见第A.6章。
4.7 SIM动力培养基：见第A.7章。
4.8 三糖铁（TSI）琼脂：按GB/T 4789.28—2003中3.4
4.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和VP试验用）：按GB/T 4789.28—2003中3.4
4.11 糖发酵培养基：见第A.8章。
4.12 过氧化氢酶试验：按GB/T 4789.28—2003中3.20
4.13 盐酸 黄溶液：见第A.3.2.1章。
4.14 奈啶酮酸钠盐溶液：见第A.3.2.2章。
4.15 柠檬酸铁铵溶液:见第A.3.2.3章.
4.16 VIDAS单核细胞增生李斯特氏菌测试条。
注：VIDAS单核细胞增生李斯特氏菌测试条是由法国梅里埃公司提供的产品的商品名，给出这一消息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可以使用这些等效产品。
4.17 API里斯特氏菌鉴定条
注：API里斯特氏菌鉴定条是由法国梅里埃公司提供的产品的商品名，给出这一消息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可以使用这些等效产品。
5、 检验程序
6、检验步骤
6.1 样品的存放与制备如为冷冻样品应于2℃~5℃解冻，且不超于18h，若不能及时检验，应置于-15℃保存，非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。
无菌取样品25g（ml）放入灭菌均质杯或均质袋中加225mLPBZE增菌液中，充分均质。
6.2 增菌培养
FB1增菌液225ML放30℃±1℃培养25h±1h吸收1ml加入10mlFB2增菌液中放30℃±1℃二次增菌25h±1h.
6.3 VIDA8快速筛选
取FB2增菌液，可按仪器生产厂的说明采取VIDA8快速筛选法进行快速筛选检测，75min可获初步结果。对于筛选为阴性的结果可直接按8.2报告来检出单核细胞李斯特氏菌。对于筛选为阳性的结果按照6.4和6.9的条款进行分离培养和鉴定。
6.4 分离培养
6.4.1 选择性培养基的分离培养
取增菌液一杯，划线分离于选择性培养基OXA、PALCAM琼脂平板上30℃±1℃培养24h~48h
6.4.2黑色菌落观察
李斯特氏菌在OXA琼脂平板上生长24h后菌落呈现黑色，直径为4mm，在其周围形成一个黑色环，培养48h，菌落仍呈黑色，直径2mm~3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在OXA琼脂平板上的菌落相似。
在OXA琼脂平板和PALCAM琼脂平板上挑选5个或更多可疑菌落，接种于TSA-YE琼脂平板上，纯培养后进行鉴定。
6.5 鉴定
6.5.1 蓝色菌落鉴定
用45°斜射光照射TSA-YE琼脂平板，菌落呈现蓝灰色到蓝色，用标准菌株作为阳性对照，将纯化后的菌落接种于TSB-YE肉汤，30℃培养24h，供生化等项目检验使用。
6.5.2 类型运动镜检
挑选在TSA-YE琼脂平板上生长良好的菌落于洁净载玻片上，用0.8%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片，于显微镜下观察，李斯特氏菌为短棒状杆菌，可见轻微的旋转翻滚。用标准菌株作为对照。
6.5.3 革兰氏染色
按照GB/T4789，38-2003进行革兰氏染色李斯特氏菌显短杆状革兰氏阳性反应。
6.5.4 过氧化氨酶实验
挑取TSA-YE平板上的菌落于洁净载玻片上，滴加1滴3%过氧化氢（H2O2）溶液，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。
6.5.5 溶血实验
将7%羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格，每格刺种一个菌落，从每个TSA-YE琼脂平板上至少挑取2个菌落刺种血平板，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌利绵羊李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h~48h，穿刺应刚刚透过琼脂层，尽量避免接触平板底部时太猛烈和和使琼脂破裂，于明亮处进行观察，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生窄小的透明β型溶血环，绵羊李斯特氏菌产生大的β型溶血环，其他李斯特氏菌种不产生溶血环，
6.5.6 动力试验
将TSB-YE肉汤培养物穿刺接种于SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）培养48h,李斯特氏菌有动力，在半固体试管内呈典型伞状生长。
6.5.7 硝酸盐还原试验
用TSB-YE肉汤培养物接种与硝酸盐肉汤中，于35℃培养5d,加入0.2ml试剂A，再加入0.2ml试剂B,轻摇混合，如在1min～2min内出现红色，判断为阳性反应，如果没有颜色显现，在含有试剂A和试剂B的试管内再加入少量锌粉，（约20mg）放置1h,如出现红色，表示仍有硝酸盐存在，未被细菌还原，判断为阴性。
6.5.8 MR-VP试验
将TSB-YE肉汤培养物接种与MR-VP肉汤中，于35℃培养48h，移取1ml培养物于洁净试管中，加5%α-萘酚溶液0.3ml，在加4%氢氧化钾溶液0.2ml，轻轻摇动试管约1min，静置约20min，出现红色为VP阳性反应，将剩余培养液继续与35℃培养48h，加甲基红指示剂1滴于试管中，出现红色为MR阳性反应，李斯特氏菌均为MR-VP阳性反应。
6.5.9 三糖铁试验
用TSB-YE肉汤培养物接种于三糖铁琼脂（TSI）,于35℃培养5d，李斯特氏菌在斜面和底层产酸，不产硫化氢
6.5.10 糖发酵试验
将TSB-YE肉汤培养物分别接种于0.5%葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内，于35℃培养21h～48h,阳性继续培养到第5天，李斯特氏菌不产气，其不同菌种生化反应见表1：
6.5.11 尿素酶试验
用TSB-YE肉汤培养物穿刺接种于尿素酶琼脂斜面上，于35℃培养5d，逐日观察李斯特氏菌成尿素酶试验阴性反应，斜面无颜色变化
6.5.12 协同溶血试验（caMP）
在羊血琼脂平板上各划一直线，使两线平行，在两平行线上分别接种β型溶血金黄色葡萄球菌
（S.aureus）ATCC4944和马红球菌（R.equi）, ATCC6939培养基，在该两线之间垂直划线接种待测菌培养基，与两线相近但不相交，于35℃培养24h~48h后，观察相交处溶血情况，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌（L.seeligeri）在靠近金黄色葡萄球菌接种点附近的的容血增强，可见有明显的箭头状溶血现象，其他李斯特氏菌不产生溶血。
6.5.13 API鉴定试验
API鉴定实验可代替6.5.7~6.5.12试验，具体方法；检查6.5.1~6.5.4中符合李斯特氏菌特征的菌株，传代分离于7%羊血琼脂平板，按API Listerin鉴定系统说明书所述方法进行鉴定，应用说明书提供的数值编码表得到鉴定结果。
6.5.4血清学检验
将TSB-YE肉汤培养基接种到3mlTSB-YE肉汤中，于35℃培养24h接种2支TSA-Y琼脂斜面，于35℃培养24h，用3ml. 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水溶中加热1h，以2500r/min离心30min，弃去2ml上清液，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液血清学玻片凝集实验，
李斯特氏菌菌种的血清型见表2
7 菌量控制
每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株（如杆菌和链球菌等）进行质量控制，在6.2样品置备的同时，在一个作为空白对照的FB1增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有10个~100个单核细胞增生李斯特氏菌的阳性标准菌株培养物稀释液1ml，和阴性菌株培养物，按检验程序进行同步检验。
8 报告结果
8.1 协同溶血试验、血清学试验可根据需要进行，常规检验可不进行这些试验。
8.2 单核细胞增生李斯特氏菌与其他李斯特氏菌种的鉴别见表1
8.2.1 报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌。
8.2.2 报告阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌。
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