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链霉菌原生质体的转化



录入时间:2012-7-30 8:50:31 来源:生物谷论坛

链霉菌原生质体的转化 1. 将最多5 ul的DNA(质粒或酶连产物)加于已经装有50 ul原生质体的指型管(1.5 ml)的管壁上(不与原生质体接触)。 2. 吸取200ul的25% PEG4000(PEG应先灭菌,再用P Buffer配置),将DNA冲入原生质体中,小心抽吸几次使之混匀。 3. 将混合物涂布于R5平板上(不含任何抗生素)。 4. 30度培养14~20 hr后(待原生质体再生后,即平板呈雾状),用含有适当抗生素的1 ml无菌水溶液覆盖。 5. 再培养1~2 d后,可以看到小的转化子菌落长出。 PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 1. 将天蓝色链霉菌库斯质粒转化进入大肠杆菌BW25113/pIJ790*菌株中,此步可用常规的CaCl2 法。(pIJ790带有cat基因和对温度敏感的复制区,培养时温度要严格控制在30゜C以下) 2. 培养含库斯质粒的BW25113/pIJ790菌株:从平板上挑取大肠杆菌单菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 (不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM )中,30゜C摇床培养过夜。 3. 取一部分过夜培养物至25ml新鲜的SOB-MgSO4 培养基(含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp)中,菌体终浓度为1% ,添加250ul 1M L-阿拉伯糖诱导λ/red 重组系统。 4. 30゜C ,200rpm摇床培养3-5h 至OD600~0.6 。 5. 将培养物倒入预冷的30ml离心管中,冰上置10min(从此细胞温度要保持在0~4゜C)。4000rpm 4゜C离心 5min。 6. 弃掉上清,加1ml预冷的10%甘油,在冰上打散沉淀,再加9ml 10%甘油,摇匀。 7. 4000rpm 4゜C离心 5min,弃掉上清,用10%甘油洗涤。重复上面操作:4000rpm 4゜C离心5min,尽量弃去上清,用残留液将细胞打散。(感受态细胞浓度越高电转效果越好) 8. 在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50ul感受态细胞与1-2ul PCR产物(经纯化,可尽量浓,但不能加得过多),混匀后立即电击,电击条件:200Ω,25uF,2.5kv, 电击结果为4.5~4.9ms 较理想。(电转化杯在70%乙醇中保存,用前先在无菌环境下用无水乙醇洗一下,再吹干,放冰上预冷,无水乙醇能加快吹干的速度。也可以选择0.1cm的电转化杯,但电击的参数就得变为:1.8 kV,?Ω,?uF) 9. 立即加1ml预冷的SOC,37゜C诱导培养40min(如需在同一库斯质粒上中断基因,则30゜C诱导培养)。 10. 涂LA(含100ug/ml Amp及与电转片段携带的抗性标记相应的抗生素)平板,37゜C过夜培养。(转化子中含有两种质粒,分别是重组前和重组后的质粒,所以要抽质粒再转化一次DH5)

 

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