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自然界工业菌种的分离筛选



录入时间:2012-1-31 14:39:44 来源:互联网

    我国幅员辽阔,各地气候条件、土质条件、植被条件差异很大,这为自然界中各种微生物的存在提供了良好的生存环境。自然界中微生物种类繁多,估计不少于几十万种,但目前已为人类研究及应用的不过千余种。由于微生物到处都有,无孔不入,所以它们在自然界大多是以混杂的形式群居于一起的。而现代发酵工业是以纯种培养为基础,故采用各种不同的筛选手段,挑选出性能良好、符合生产需要的纯种是工业育种的关键一步。自然界工业菌种分离筛选的主要步骤是:采样、增殖培养、培养分离和筛选。如果产物与食品制造有关,还需对菌种进行毒性鉴定。 
1.    采样 
    以采集土壤为主。一般在有机质较多的肥沃土壤中,微生物的数量最多,中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主,酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多,果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多。采样的对象也可以是植物,腐败物品,某些水域等。采样应充分考虑采样的季节性和时间因素,以温度适中,雨量不多的秋初为好。因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的,如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少,暴雨后土壤中微生物会显著减少。采样方式是在选好适当地点后,用无菌刮铲、土样采集器等,采集有代表性的样品,如特定的土样类型和土层,叶子碎屑和腐质,根系及根系周围区域,海底水,泥及沉积物,植物表皮及各部,阴沟污水及污泥,反色动物第一胃内含物,发酵食品等。 
    具体采集土样时,就森林、旱地、草地而言,可先掘洞,由土壤下层向上层顺序采集;就水田等浸水土壤而言,一般是在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格,可取离地面5~15cm处的土。将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理,暂不能处理的也应贮存于4℃下,但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束,试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境,其内部生态环境就会发生变化,微生物群体之间就会出现消长。如果要分离嗜冷菌,则在室温下保存试样会使嗜冷菌数量明显降低。 
    在采集植物根际土样时,一般方法是将植物根从土壤中慢慢拔出,浸渍在大量无菌水中约20min,洗去粘附在根上的土壤,然后再用无菌水漂洗下根部残留的土,这部分土即为根际土样。  
    在采集水样时,将水样收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙,应从较深的静水层中采集水样。方法是:握住采样瓶浸入水中30~50cm处,瓶口朝下打开瓶盖,让水样进入。如果有急流存在的话,应直接将瓶口反向于急流。水样采集完毕时,应迅速从水中取出采集瓶并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶,采集的水样应在24h之内迅速进行检测,或者4℃下贮存。 
2.    增殖培养 
    一般情况下,采来的样品可以直接进行分离,但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多,而另一些微生物却大量存在。此时,为了容易分离到所需要的菌种,让无关的微生物至少是在数量上不要增加,即设法增加所要菌种的数量,以增加分离的几率。可以通过选择性的配制培养基(如营养成分、添加抑制剂等),选择一定的培养条件(如培养温度、培养基酸碱度等)来控制。具体方法是根据微生物利用碳源的特点,可选定糖、淀粉、纤维素,或者石油等,以其中的一种为唯一碳源,那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长,而其他微生物就可能死亡或淘汰。对G一菌有选择的培养基(如结晶紫营养培养基、红—紫胆汁琼脂、煌绿胆汁琼脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分离细菌时,培养基中添加浓度一般为50μg/m1的抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素),可以抑制真菌的生长。在分离放线菌时,通常于培养基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、岩石、有机混合腐质等的浸出汁)  作为最初分离的促进因子,由此可以分离出更多不同类型的放线菌类型;放线菌还可以十分有效地利用低浓度的底物和复杂底物(如几丁质),因此,大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的,而不是在含丰富营养的生长培养基上分离的;在放线菌分离琼脂中通常加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮,以抑制真菌的繁殖;此外,为了对某些特殊种类的放线菌进行富集和分离,可选择性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分离真菌时,利用低碳/氮比的培养基可使真菌生长菌落分散,利于计数、分离和签定;在分离培养基中加入一定的抗生素如氯霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、链霉素等即可有效地抑制细菌生长及其菌落形成;抑制细菌的另外一些方法有:在使用平皿之前,将平皿先干燥3~4天;降低培养基的pH值或在无法降低pH时,加入1:30000玫瑰红。这样有利于下阶段的纯种分离。 
3.    培养分离 
    通过增殖培养,样品中的微生物还是处于混杂生长状态。因此还必须分离,纯化。在这一步,增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用,而且要控制得细一点,好一点。同时必须进行纯种分离,常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。稀释分离法的基本方法是将样品进行适当稀释,然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养,待长出独立的单个菌落,进行挑选分离。划线分离法要首先倒培养基平板,然后用接种针(接种环)挑取样品,在平板上划线。划线方法可用分步划线法或一次划线法,无论用哪种方法,基本原则是确保培养出单个菌落。组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离。分离时,首先用10%漂白粉或0.1%升汞液对植物或器官组织进行表面消毒,用无菌水洗涤数次后,移植到培养皿中的培养基上,于适宜温度培养数天后,可见微生物向组织块周围扩展生长。经菌落特征和细胞特征观察确认后,即可由菌落边缘挑取部分菌种进行移接斜面培养。 
    对于有些微生物如毛霉、根霉等在分离时,由于其菌丝的蔓延性,极易生长成片,很难挑取单菌落。常在培养基中添加0.1%的去氧胆酸钠或在察氏培养基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖,利于单菌落的分离。 
4.    筛选 
    经过分离培养,在平板上出现很多单个菌落,通过菌落形态观察,选出所需菌落,然后取菌落的一半进行菌种鉴定,对于符合目的菌特性的菌落,可将之转移到试管斜面纯培养。这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株,它只是筛选的第一步,所得菌种是否具有生产上的实用价值,能否作为生产菌株,还必须采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,以求得适合于工业生产用菌种。这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,以求得适合于工业生产用菌种。如果此野生型菌株产量偏低,达不到工业生产的要求,可以留之作为菌种选育的出发菌株。 
5.    毒性试验    
    自然界的一些微生物在一定条件下将产生毒素,为了保证食品的安全性,凡是与食品工业有关的菌种,除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外,其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。

 

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