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实验:革兰氏染色法



录入时间:2011-12-26 15:28:01 来源:生物在线

实验目的 

1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 

2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 

实验内容 

1.制作细菌染色装片。 

2.分别对单菌和混菌进行革兰氏染色法操作。 

实验原理 

    用于生物染色的染料主要有碱性染料、 酸性染料和中性染料三大类。 碱性染料的离子带正电荷,能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷,能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH下降时,细菌所带正电荷增加,因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料,如伊红美蓝、伊红天青等。 

    革兰氏染色法是 1884年由丹麦病理学家 C.Gram所创立的。 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。 

    该染色法所以能将细菌分为 G+菌和 G—菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色, 再经蕃红复染后就成红色。G+  菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高, 类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。 

实验器材 

    培养 12-16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis),培养 24 小时的大肠杆菌(Escherichia coli) 

    结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、液体石蜡、擦镜液 

    载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。 

实验步骤 

一、单菌的革兰氏染色: 

    分别取枯草杆菌、大肠杆菌进行革兰氏染色。 

1.制片: 

(1) 涂菌:取干净载玻片一块,在载玻片上加一滴生理盐水,按无菌操作法取菌涂片,注意取菌不要太多。 

(2) 干燥:让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 

(3)固定:手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰 2-3次固定(以不烫手为宜)

2.染色 

(1) 初染:滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色 1~2min,水洗。 

(2) 媒染:用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约 1min,水洗。 

(3) 脱色:用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加 95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗。 

(4) 复染:用番红液复染约 2min,水洗。 

3.镜检:干燥后,用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌,被染成红色的为革兰氏阴性菌。 

二、混菌的革兰氏染色: 

    按上述方法,在同一载玻片上,以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作混和涂片、染色、镜检进行比较。 

实验结果及讨论 

1.实验结果 

    列表简述 2株细菌的染色观察结果(说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应),分别绘制单菌及混菌的染色结果。 

2.讨论 

    针对实验原理、步骤、现象进行讨论。 

实验作业 

1.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么? 

2.进行革兰氏染色时,为什么特别强调菌龄不能太老,用老龄细菌染色会出现什么问题? 

 

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