实验目的

    掌握细菌的鞭毛染色技术。 

实验内容 

    学习细菌的鞭毛染色法。 

实验原理 

    细菌的鞭毛极细，直径一般为 10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。 

实验器材 

培养 12-16h的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。 

银染色液、Leifson染色液、香柏油、二甲苯。 

载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。 

实验步骤 

1．镀银法染色 

(1) 清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上， 然后将玻片置洗衣粉过滤液中 （洗衣粉煮沸后用滤纸过滤， 以除去粗颗粒）， 煮沸 20min。 

取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡 5—6天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入 95%乙醇中脱水。 

(2) 菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接 3-5 代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养 12—16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有 1—2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在 37℃恒温箱中静置10min （放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。 

    用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将 0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了 3-4代的细菌，恒温培养 12-16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。 

(3) 染色 

① 滴加 A液，染 4—6min。 

② 用蒸馏水充分洗净 A液。 

③ 用 B 液冲去残水，再加 B 液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持 0.5—1min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。 

④ 用蒸馏水洗，自然干燥。

(4) 镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。 

    结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。 

2．改良 Leifson染色法 

(1) 清洗玻片法同 1。 

(2) 配制染料  染料配好后要过滤 15-20次后染色效果才好。 

(3) 菌液的制备及涂片 

① 菌液的制备同 1。 

② 用记号笔在洁净的玻片上划分 3—4个相等的区域。 

③ 放 1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。 

④ 干燥  在空气中自然干燥。 

(4) 染色 

① 加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推 （相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。 

② 水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。 

③ 干燥：自然干燥。 

(5) 镜检  先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要企图在 1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。 

    结果：菌体和鞭毛均染成红色。 

注意事项 

1．镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放，比较麻烦。 

2．Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经 15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。 

3．细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。 

4．染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。 

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