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植物组培的操作技术:灭菌和接种(2)



录入时间:2011-12-26 10:26:36 来源:互联网

 

.空间灭菌采用紫外线和熏蒸灭菌

1.紫外线灭菌

1)适宜:接种室、超净台的空间。只适于空气和物体表面的灭菌

2)原理:细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成死亡。

3)特点:紫外线的波长为200300nm,其中以260nm的杀菌能力最强,但是紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于表面灭菌,且要求距照射物以不超过1.2m为宜.

2.熏蒸灭菌 ‘

1)概念:用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需空间关闭紧密。

2)原理:使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。

3)特点:一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好。浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外。另外,消毒剂必须制成水溶状态。墙壁先喷湿会加强效果。房间要关闭紧密。

4)药品:常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,按58ml/m3用量,加g/m3高锰酸钾促氧化挥发。冰醋酸也可,但不如甲醛。

   6.一些物表用药剂喷雾或擦拭灭菌

   物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用70%的酒精反复涂擦灭菌,1%~2%的来苏儿溶液以及0.25~1%的新洁尔灭也可以。

   7. 植物材料表面用消毒剂灭菌 

    植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。

    第一步是清洗 把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。洗时可加入洗衣粉或表面活性物质-吐温助洗,最后用自来水冲净。

第二步是表面浸润。严格要求要在超净台内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸30秒左右。 

作用:使植物材料表面被浸湿。但要把握时间。70%酒精穿透力强,对特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等,以及主要取用内部的材料,可处理稍长一些。

第三步是灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取(见下表)

4-2 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表

灭菌剂

使用浓度

持续时间(min)

去除的难易

效果

次氯酸钙

910%

530

很好

次氯酸钠

2%

530

很好

氯化汞

011%

58

较难

最好

抗菌素

450mg/L

3060

较好

   

次氯酸钠和次氯酸钙在使用前临时配制,都是利用其分解产生氯气来杀菌,故灭菌时用广口瓶加盖较好;灭菌效果次于氯化汞,得易于去除。

氯化汞可短期内贮用。氯化汞也称升汞,为剧毒物质,它由重金属汞离子破坏微生物蛋白质等来达到灭菌目的;特点是灭菌效果好,得去除残毒较难,应当用无菌水涮洗810次,每次不少于3min,

过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水涮洗34次即可;而

灭菌作法:沥干的植物材料转到较大器皿中,倒入消毒液开始记时,并不断用玻璃棒轻轻搅动,以驱除气泡促进接触和消毒彻底。用倾倒法灭菌液要充分浸没材料。

   灭菌液中可加吐温-80Triton X,使药剂更易于展布和浸入到的材料表面。一般加入灭菌液的0.5%,即在100ml加入15滴。

最后一步是用无菌水涮洗,作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。涮洗要每次3min左右,视情况,涮洗310次左右。

二、无菌操作

接种时由于有一个敞口的过程,所以是极易引起污染的时期,这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外,还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾,使空气中灰尘颗粒沉降下来。工作人员进入接种室前双手必须进行洁净,先用水和肥皂洗涤,操作前再用70%酒精擦试,操作时双手不能随便接触未经消毒的东西。入室前穿好灭菌的专用实验服和换托鞋,专用实验服要经常保持清洁并消毒。头发带的灰尘也很多,因此应戴上专用帽子。工作人员的呼吸也是污染的主要途径,操作规程过程禁止不必要的谈话和咳嗽,可带上口罩。还要尽量减少工作人员在接种室内的走动。

操作期间,尽量把所用的器皿盖子盖好。刀、剪、镊子等用具,一般在使用前浸泡在70%的酒精中,用时再在火焰上消毒,待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。工作结束,及时取出接种材料,然后清理台面,再用5%的来苏儿或石炭酸全面喷雾或打开紫外线照射半小时。

三、接种

    接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官,经切割或剪裁成小段或小块,放入培养基的过程。以上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌,现将接种前后的程序连贯地介绍。

()将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗.最后沥去水分,取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。

(二)材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含12片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。

(三)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,试管口靠近酒精灯火焰,将管口在火焰上方转动,让管口里外灼烧数秒钟,若用棉塞盖口,可先在管口外面灼烧,去掉棉塞,再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上,以放13块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外,其它尚无统一要求。放置材料数量现在倾向少放,通过统计认为:对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜,这样节约培养基和人力,一旦培养物污染可以抛弃。接完种后,将管口在火焰上再灼烧数秒钟。若用棉塞,塞好后,包上包口纸,包口纸里面也要过火。

 

 

 

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