下面以MS培养为例,其成分可以分为水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
1.水
作用:原生质体的组成成分,代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中。配制:培养基母液时要用蒸馏水:配培养基时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水。
2.无机元素
大量元素,指浓度大于0.5mmol/l的元素,有N、P、K、Ca、Mg、S等。其作用是:
(1)N
功能:是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分,是生命结构和功能物质不可缺少的。
供应形式:含有NO3-N又含NH4-N。NH4-N对植物生长较为有利。在制备培养基时以这两种形式供应。供应的物质有KNO3、、NH4NO3等。有时,也添加氨基酸。
(2)P
功能:是磷脂的主要成分,而磷脂又是细胞膜、细胞核的重要组成部分。磷也是核酸、ATP、辅酶等的组成成分。组织培养中,磷不仅增加养分、提供能量,而且也促进对N的吸收,增加蛋白质在植物体中的积累。
供应形式:常用的物质有KH2PO4或NaH2PO4等。
(3)K
功能:K对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系,它具有活化酶的作用。K增加时,蛋白质合成增加,维管束、纤维组织发达,对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大,一般为1~3mg/l为好。
供应形式:制备培养基时,常以KCl、KNO3 等盐类提供。
(4) Mg、S和Ca
功能: Mg是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂;S是含硫氨基酸所构成蛋白质的组成成分。Ca 是构成细胞壁的一种成分,Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用,
供应形式:以MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O提供。
(5)微量元素
种类:指小于0.5mmol/l的元素, Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等。
功能:铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时,它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等,也是植物组织培养中不可缺少的元素,缺少这些物质会导致生长,发育异常现象。
供应形式:因其在pH5.2以上,易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀,故用Fe SO4·7H2O和 Na2-EDTA结合成螯合物使用。
当某些营养元素供应不足时,愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮,会表现出一种花色素苷的颜色,不能形成导管;缺铁,细胞停止分裂;缺硫,表现出非常明显的褪绿;缺锰或钼,则影响细胞的伸长。
3.有机化合物
(1)碳水化合物
供应形式:最常用蔗糖,葡萄糖和果糖也较好,麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖也有应用。
使用浓度:2~3%,常用3%,即配制1升培养基称取30g蔗糖,有时可用2.5%,但在胚培养时采用4~15%的高浓度,因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。
用量注意:不同糖类对生长的影响不同。以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相当,麦芽糖差一些;不同植物不同组织的糖类需要量也不同,
代用品:在大规模生产时,可用食用的绵白糖代替。
(2)维生素
种类:主要有VB1 (盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VPP(烟酸)、VC(抗坏血酸) 、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。一般用量为0.1~1.0mg/l。有时用量较高。
功能:以各种辅酶的形式参与多种代谢活动,促进生长、分化作用。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用,VB6能促进根的生长,VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系。VC有防止组织变褐的作用。
(3)肌醇 又叫环己六醇,
功能:参与构建细胞壁。由磷酸葡萄糖转化而来,进一步生成果胶物质。
肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸,植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁,植酸可进一步形成磷脂,参与细胞膜的构建。
能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。促进组织和细胞的繁殖、分化。
使用浓度:一般为100mg/l,
(4)氨基酸
功能:作为有机氮源,利于被细胞直接吸收利用。
常用种类:甘氨酸,其它如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。
特殊应用:用水解乳蛋白或水解酪蛋白,是牛乳用酶法等加工的水解产物,含有约二十种氨基酸的混合物,使用注意用量在10~1000mg/l之间。否则极易引起污染。
(5)天然复合物 大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用,但对器官的分化作用不明显。
①椰乳 是椰乳的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10~20%。
功能:它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用,但茎尖组织的大小若超过1mm时,椰乳就不发生作用。
其它②香蕉③马铃薯④水解酪蛋白⑤酵母提取液(YE)(0.01~0.05%),
4.植物激素 是培养基的关键物质,对植物组织培养起着决定性作用。
(1)生长素类
功能:1诱导愈伤组织形成,2诱导根的分化 3促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面,根对生长素最敏感。在极低的浓度下,(10-5~10-8mg/L)就可促进生长,其次是茎和芽。
性质:天然的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏。在体内易受酶解。故常用人工生长素类物质。
配制方法:用少量95%酒精助溶。2,4-D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶。配后贮于冰箱中。
IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)
来源:天然存在的生长素,亦可人工合成,
性质:是活力最弱的激素,对器官形成的副作用小,高温高压易被破坏,也易被胞中的IAA分解酶和光照降解。
NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)
来源:来自大批量人工合成,
性质:在组织培养中的起动能力要比IAA高出3~4倍, 耐高温高压,不易被分解破坏,所以应用较普遍。
作用:NAA和IBA广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。
IBA(indolebutyric acid吲哚丁酸)
来源:人工合成
作用:促进发根能力最强。
2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)
起动能力比IAA高10倍,
功能:特别在促进愈伤组织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄,过量常有毒效应。
(2)GA(gibberellic acid赤霉素) 有20多种,培养基中常添加是GA3生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同,
作用:1促进幼苗茎的伸长生长,2赤霉素还用于打破休眠,促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。3添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。
配制:可用少量95%酒精助溶。赤霉素不耐热,高压灭菌后将有70~100%失效,应当采用过滤灭菌法加入。
(3)细胞分裂素类
性质和种类:是腺嘌呤的衍生物,包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、Zt(zeatin玉米素)等。
其中ZT活性最强,但非常昂贵,常用的是6-BA。
作用:①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长,②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。因此,多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖,避免在生根应用。
生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,
生长调节物质的使用甚微,一般生长素浓度的使用为0.05~5mg/l, 细胞分裂素0.05~10mg/L。
5.培养材料的支持物
(1) 琼脂
功能:只是固化剂。本身并不提供任何营养。
性质:琼脂能溶解在热水90℃以上中,成为溶胶,冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。
用量:在6~10g/l之间,若浓度太高,培养基就会变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低,凝固性不好
质量:一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。
凝固能力:除与原料、厂家的加工方式有关外,还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。时间过久,琼脂变褐,也会逐渐丧失凝固能力。
固体培养基优缺点:操作简便,通气问题易于解决,便于观察研究等,但培养物与培养基的接触面小,各种养分扩散较慢,
(2)其它 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等,总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。
6.抗生物质antibiotic
种类:抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在5~20mg/l之间。
作用:防止菌类污染,
7. 抗氧化物
种类半胱氨酸及Vc,常用50~200mg/l的浓度,其它抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。
原理:植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质,接触空气中的氧气后,自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类,产生可见的茶色、褐色以致黑色,这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒,使培养的材料生长停顿,失去分化能力,最终变褐死亡。木本植物较严重,
8. 活性炭active carbon
性质:活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构,它结构疏松,孔隙大,吸水力强,有很强的吸附作用
使用浓度:通常使用浓度为0.5-10g/l。
作用:1吸附非极性物质和色素等大分子物质,包括琼脂中所含的杂质,培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。
茎尖初代培养,新梢增殖阶段,活性炭有效,
2 促进生根
其机理一般认为与活性炭减弱光照有关,可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA,但IAA易受可见光的光氧化而破坏,
副作用:研究表示,每毫克的活性炭能吸附100毫微克左右的生长调节物质。
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