【摘要】  目的 筛选新的菊酯农药降解酶基因并了解其特性，为解决食品和环境中的菊酯农药残留问题创造条件。方法 通过构建基因文库的方式筛选获得新的菊酯农药降解酶 (EstP) 基因，并对其进行一系列生物信息学分析。结果 获得了新的菊酯农药降解酶 (EstP) 基因。EstP 属于水解酶类，由 638 个氨基酸编码，预测分子量为 73.4 kDa，pI 值为 8.34，与其他蛋白相似性极低，不属于任何已知的蛋白超家族，仅与羧肽酶Taq (M32) 的保守域具有一定相似性，推测 Lys137, Glu116, Glu148 为其必需氨基酸。 结论 新的菊酯农药降解基因得到克隆，生物信息学分析为其定向进化提供了理论指导，为高效基因工程菌的构建打下了基础。

【关键词】  菊酯农药降解酶；基因克隆；菊酯农药；生物信息学分析

　　拟除虫菊酯为第三代杀虫剂，其长期广泛的使用，对土壤、大气和水源等造成了不同程度的污染［1］ 。其对健康的危害也不容忽视，主要包括对免疫系统的胁迫，对淋巴结和脾脏的损伤、致癌以及环境激素效应等［2］ 。寻找一种有效方法消除或降低食品和环境中的菊酯农药残留已成为当前迫切需要解决的问题。
    　　
　　在过去的研究工作中，本实验室获得了一株能以菊酯为唯一碳源和氮源生长的伯雷克氏菌株Klebsiella sp. ZD112，鉴于直接应用农药降解酶制剂比应用产酶的菌剂更有优势［3］，为了能够产业化生产菊酯农药降解酶，通过构建基因文库的方式获得了新的菊酯农药降解酶基因，并进行了一系列生物信息学分析，为高效基因工程菌的构建打下基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  培养基
    　　
　　LB培养基与LA培养基按照分子克隆手册配制。筛选培养基为加入 100 mg/L 氨苄青霉素（ampicillin）和100 μmol/L 5bromo4chloro3indolylcaprylate (Xcaprylate)的 LB培养基（Xcaprylate可被水解酶水解而形成蓝色的水解圈［4］）。

　　1.2  菌株
      
　　大肠杆菌DH5α ［supE44, Δ lacU169 (φ80 lacZΔM15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1］由本实验室保存，菊酯农药降解酶生产菌株Klebsiella sp. ZD112 菌株由本实验室从污染土壤分离。pUC18质粒购自TaKaRa公司。

　　1.3  酶和试剂
      
　　各种限制性内切酶、DNA marker、XGal、IPTG购自TaKaRa公司,T4连接酶、去磷酸化酶购自MBI公司。其他生物化学试剂均为国产分析纯。

　　1.4  基因文库的构建
      
　　参照分子克隆手册提取Klebsiella sp.ZD112基因组DNA和pUC18质粒。ZD112基因组DNA经HindⅢ不完全酶切后电泳，按照3 S DNA Gel Purification kit试剂盒说明书割胶回收2～10 kb片断。pUC18经 HindⅢ酶切后去磷酸化后并电泳，割胶回收。将酶切并回收的DNA片断与去磷酸化的克隆载体按5∶1的比例16 ℃连接过夜，Ca转入大肠杆菌DH5α，并涂布LA平板，进行蓝白斑筛选。

　　1.5  目标亚克隆的筛选
　挑取白色的转化子到含酯酶底物(Xcaprylate)的筛选平板上培养过夜，挑取有蓝色水解圈形成的转化子保存并接种于LA液体培养基中振荡培养。提取质粒酶切验证，同时破碎菌体提取粗酶液,测定其对氯氰菊酯的降解率。

　　1.6亚克隆测序与分析
       
　　测序由上海博亚生物公司完成。对插入片断通过ORF Finder ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html )寻找读码框，并采用BLASTn ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )进行同源性分析。
  
　　1.7  目的基因生物信息学分析
      
　　分子量和等电点计算采用DNAstar5.0 软件计算；蛋白保守域查询采用rpsBlast ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi )，数据库选择为 CDD v2.06-11530 PSMMs，鉴于 EstP 与其他蛋白的同源性非常低，E 值选择时适当放宽，设为 1；酶与非酶分析采用基于蛋白氨基酸序列性质的 ArchaeaFun 1.0 Server (http://genome.cbs.dtu.dk/ services/Archaea Fun)；蛋白超家族分析采用基于隐马尔科夫 (Hidden Markov Model, HMM) 算法的 Superfamily 1.61 (http://supfam.mrclmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/) ，参数选择：example sequence: Amino acid sequence，Scoring options: Local/local model/sequence scoring，Blast Prefilter Pvalue<10e10；蛋白亚细胞定位采用 Loctree 服务器(http://cubic.bioc.columbia.edu/services/loctree/ )；EstP的多序列比对使用 Clustal X 软件，相似序列由rpsBlast 获得，蛋白势能矩阵选择为 Blosum series。

　　2  结果与分析

　　2.1  基因文库的构建
                
　　通过蓝白斑筛选，共获得白色克隆约3万个。ZD112基因组DNA不完全酶切结果见图1，质粒pUC18的Hind Ⅲ酶切图见图2。

　　2.2  目标亚克隆的筛选与鉴定
       
　　挑取1 500个阳性克隆至到含底物（Xcaprylate）筛选培养基。获得4个能在筛选培养基产生蓝色水解圈的单菌落，挑取后加入Amp含量为100 mg/L的 LB液体培养基培养,甘油保存。其粗酶液对氯氰菊酯的降解率见表1，ZD112粗酶液作对照［5］。
       
　　挑选降解率高的阳性克隆子LA5进行酶切（图3），从图中可知，L5A 连接上了大约3.6 kb左右的片段,送测序公司测序(图4) 。

    用NCBI上的工具ORF finder分析LA5的克隆片段,发现其含有2个较大的开放读码框(ORF),一个长度为1 914 bp(ORF1，登录号: AY995176),另外一个长度为756 bp(ORF2，登录号: AY954696)。其中ORF1仅与2个细菌预测蛋白有一定相似性（hypothetical protein SC171：88%相似；ebA4602：36 %相似），并含有-10,-35以及RBS(ribosomal binding site)序列（图5），因此该ORF可能是编码菊酯降解酶 (EstP) 的新基因。表1  各阳性克隆与ZD112的降解率（略）

　　2.3  生物信息学分析结果
    　　
　　EstP由637 个氨基酸组成，经DNAstar5.0计算出其分子量为 73.4 kDa，pI 值为 8.34。蛋白亚细胞定位分析结果显示，EstP 属于细胞质内蛋白。酶与非酶的分析结果表明，EstP 是酶，并且属于水解酶类。
    　
　　进一步分析发现，EstP 不属于任何已知的蛋白超家族，与 EstP 具同源性的已知蛋白也非常少。rpsBlast 分析表明，EstP 仅有一段很短的序列（71～149氨基酸区段）与羧肽酶 Taq (M32) 的保守域有最高的相似性，这段序列还与预测膜蛋白 COGO0012 有一定的相似性。

    通过对已知结构蛋白 Taq (M32) 的三级结构的分析发现，其与 EstP 具有同源性的序列呈 V 字型，且Taq (M32) 的活性位点正位于这一区段内，由此，推测 EstP 的活性中心可能位于其 71～149 氨基酸区段内。

　　3  讨 论
    　　
　　作为目前最有发展前途的杀虫剂，拟除虫菊酯尚未找到新型的替代化合物，在未来十几年内仍将广泛使用。采用微生物农药降解酶解决菊酯农药残留污染问题是当前环境科学研究的热点,也是一个较新的研究领域。由于农药降解酶在野生菌株中含量太低，生产成本高昂且难以大量生产，如何产业化地生产农药降解酶成为农药降解酶应用必须解决一个关键性问题。农药降解酶基因的克隆、表达以及定向进化可以构建出降解谱广、降解能力强的工程菌，为微生物降解农药开辟了新途径。
    　　
　　在之前的研究中，本实验室从农药厂的污泥中筛选出能降解菊酯农药的伯雷克氏菌株 Klebsiella sp. Strain ZD112 。通过构建基因文库的方式，获得了一个具有菊酯降解活性的克隆子，对测序结果进行 ORF 分析，该ORF1在NCBI上比对的结果都是一些细菌的预测蛋白，如：它与Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis的预测蛋白hypothetical protein SC171(登录号: AAS76447.1)有88%一致性；与Azoarcus sp. EbN1的预测蛋白ebA4602(登录号: YP159633.1)有36 %的一致性。他们的功能都还没有确定,目前为止尚未见有菊酯类农药降解基因的报道。因此本研究克隆出来的基因有可能是一个新的菊酯农药降解基因。
    　　
　　对该基因的生物信息学分析显示，EstP 为水解酶且为胞内蛋白，这与前期实验结论完全吻合［5］。根据其与羧肽酶 Taq (M32) 保守域所表现的较高相似性，推测其氨基酸序列的 71～149 为其活性中心所在，必需氨基酸为 Glu116, Lys137，Glu148，这一结论的得出为 EstP 的定向进化提供了理论指导。然而，EstP 与其他已知蛋白序列相似性极低，且不属于任何蛋白超级家族，这增加了对其研究的难度。
    　　
　　对这样一个全新水解酶的进一步研究，一方面，可深入了解菊酯降解酶的作用机制［6］，具有深刻的理论意义；另一方面，高效工程菌的开发有助于菊酯农药残留降解，在保护生态环境、突破绿色壁垒、维护人民健康等方面具有很大的应用潜力。

【参考文献】
  　　［1］MIYAMOTO J, KANEKO H, TSUJI R, et al. Pyrethroids, nerve poisons : how their risks to human health should be assessed ［J］. Toxicol Lett, 1995, 83: 933-940.

　　［2］PARK E K, KIM J H, GEE S J, et al. Determination of pyrethroid residues in agricultural products by an enzymelinked immunosorbent assay ［J］. J Agric Food Chem, 2004, 52: 5572-5576.

　　［3］虞云龙，樊德方，陈鹤鑫．农药微生物降解的研究现状与发展策略［J］．环境科学进展，1996，4：28-34．

　　［4］CHOI Y J, MIGUEZ C B, LEE B H. Characterization and heterologous gene expression of a novel esterase from Lactobacillus casei CL96 ［J］. Appl Environ Microbiol, 2004, 70: 3213-3221.

　　［5］梁卫驱,刘玉焕，李荷.氯氰菊酯降解菌的分离鉴定及其降解特性研究［J］.广东药学院学报,2007,23 (2)：199.

　　［6］皮埃尔·巴迪尔，索恩·布鲁纳克．生物信息学－机械学习方法［M］．北京：中信出版社，2003：211-219．