自然界的菌种资源虽十分丰富,但是要设法从其中筛到较为理想的菌种也不十分容易。据链霉素发现者S.A.Waksman总结筛选链霉素产生菌的经过就可知道其中的甘苦了:他的研究小组从土壤中分离约1万株放线菌,发现其中约有1千株对预定试验菌有拮抗作用,其中的1百株具有较好的液体发酵性能,又从其中选出10株产链霉素性能较好的菌株,最后,再从中挑出一株有生产价值的链霉素产生菌——Streptomycesgriseus(灰色链霉菌)。因此,这真正可称得上是一项“万里挑一”的工作了。
工业生产上常用的菌种按其产物的性质来说,不外乎三类;①生产菌体物质;②生产分解酶类;③生产各种主流代谢产物、次生代谢产物或生物合成产物,例如乙醇、丙酮、丁醇、乙酸、乳酸、柠檬酸、谷氨酸、赖氨酸、肌苷酸、维生素、赤霉素、抗生素或细菌外毒素等。如果我们要筛选的菌种在试样中含量很高,那么,筛选的过程只要采集含菌样品、纯种分离和进行生产性能测定三步即可;如果要筛选的菌种在试样中含量极低,那么,在采集含菌样品后,还得加上富集培养(enrichmentculture),然后才能进行纯种分离和生产性能测定。以下就这四个步骤分别加以介绍。
(一)采集菌样
采集含菌样品前,先应调查一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多,然后才可着手做各项具体工作。由于在土壤中几乎可找到任何微生物,所以土壤往往是首选的采集目标。除土壤外,其他各类对象上都有相应的占优势生长的微生物,例如在腐木和堆肥中纤维素和木质素分解菌较多;在果实、蜜饯表面酵母菌较多;在蔬菜、牛奶中乳酸菌较多;在动物肠道和粪便中,革兰氏阴性无芽孢厌养菌和肠道细菌较多;在谷物种子上曲霉、青霉和镰孢霉较多;而在油田、炼油厂附近的土壤中,则以石油分解微生物较多。
现以从土壤中筛选抗生素产生菌为例来介绍采样中必须考虑到的几个问题。
(1)土壤中有机物的含量 有机物含量高,土质就肥,一般在其中微生物数量也越多,反之亦然。过于肥沃的土壤,往往细菌的含量过多,而放线菌却比较少。因此,在寻找拮抗性放线菌时,一般可采集一些园土或耕作过的农田土。而要分离拮抗性真菌时,由于它们对碳水化合物需要量较大,故可到植物残体丰富的枯枝落叶层下的土壤或沼泽土中去寻找。
(2)采土的深度 土壤的深度不同,其通气、养分和水分的分布情况也不同。表层的土壤由于直接受日光曝晒,故较干燥,微生物也不易大量繁殖。在离地面5~20cm处的土壤,微生物含量最高。
(3)植被情况 植被的种类对微生物的分布有着密切的关系。例如,在冬天灌水的水稻田土壤中,以真菌Cephalosporium(头孢霉属)的种类较多。但总的说来,这方面的规律还知道得很少。
(4)采土的季节 以春秋两季为宜。这时土壤中的养分、水分和温度都较适宜,微生物的数量也最多。采土时尤应注意土壤中的含水量,水分过多会造成厌氧环境,不利于放线菌的生长繁殖。真菌虽需要较高的相对湿度,但基质中的水分却不宜过多。因此要避免在雨季采集土样。此外,土壤的pH也应适当注意,细菌和放线菌在中性或微碱性土壤中居多,而真菌则在偏酸性的土壤中较丰富。
(5)采土方法 选择好适当地点后,用小铲子除去表土,取5~20cm处的土样几十克,盛入事先灭过菌的防水纸袋内,并在上记录采土时间、地点和植被等情况。采好的土样应尽快分离。在采土的时候,一个地区采土的点不能太少,否则就不能代表该地区的微生物类群。
大体上来说,我国南方各省的气候适宜,土质较肥沃,故微生物的种类和数量较多,而北方的黄土、砂土中则拮抗性放线菌较少,但东北的肥沃黑钙土也有丰富的拮抗性放线菌。
(二)富集培养
又称增殖培养。就是利用选择性培养基的原理,在所采集的土壤等含菌样品中加入某些特殊营养物,并创造一些有利于待分离对象生长的条件,使样品中少数能分解利用这类营养物的微生物乘机大量繁殖,从而有利于分离它们。
根据微生物的营养特性可以知道,如果自然菌样中含有某一物质较多,则其中含有能分解这一物质的微生物一般也较多。如果原有菌样中这类微生物不多,则可人为地加入相应的基质以促使它们生长繁殖。例如,通常可在土壤中加入一些石油以促使其中少数能利用石油作碳源的微生物数量剧增;又如,在土样中加入纤维素也可以富集纤维素分解微生物,等等。但是,这类富集方法,一般不适用于分离能产生某些物质的微生物。例如,不可能把谷氨酸加入到土壤样品中去,以使产谷氨酸的微生物大量繁殖。不过,如果我们已知道所要分离微生物的某些特殊生理特性,也可以采用有利于这种微生物而不利于其他无关微生物的营养和培养条件,以达到富集培养的目的
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